响应面法优化超声波辅助提取黄栌叶漆黄素的工艺

许凯扬，徐娜，李彦，王满生

1.长沙理工大学食品与生物工程学院（长沙 410114）；2.中国农业科学院麻类研究所（长沙 410205）

黄栌（Cotinus coggygriaScop.）为漆树科黄栌属（CotinusL.）植物，乔木或灌木[1]，一直被用作保持水土的防护林和园林绿化的景观植物，也作为化工鞣化剂。虽尚未作为药材收载入《中国药典》，但许多药理和药效学实验均表明黄栌具有治疗湿热型黄疸、抗肝炎、止泻、抗菌等作用[2-4]。黄栌富含黄酮类化合物、单宁、多酚类物质及有机酸类等，还含有多种微量元素，例如钾、钠、铝、镁、硅、钙、磷[5]。至今，从黄栌中共分离出18种黄酮类化合物，全棵不同地方的总黄酮量从大到小为根、枝茎、叶子[6]。例如，黄栌根和茎中黄酮类化合物含量为6.75%[7]。张正臣等[8]首次从黄栌中分离出3,7,3’,4’-四羟基黄酮即漆黄素（fisetin），是黄栌中抗肝炎的有效成分[9]。研究表明，漆黄素可通过诱导肿瘤细胞凋亡、影响肿瘤细胞信号转导通路、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭等途径发挥抗肿瘤的作用[10-12]。漆黄素为黄色针状结晶，分子式为C15H10O6，溶于乙醇、丙酮、乙酸、氢氧化物碱溶液，不溶于水、乙醚、苯、氯仿和石油醚[13]。

天然色素提取通常采用溶剂提取法。近年来，超声、微波等辅助手段可提高提取率，其中，超声辅助提取技术是利用超声波的强振动、高加速度、强空化效应、强搅拌作用来缩短天然产物有效成分进入溶剂的时间，加快提取过程，提高提取率，并有效避免高温对有效成分的破坏[14-16]。

近年来，研究者主要围绕黄栌的药理活性开展了研究，而关于其有效成分的提取工艺报道较少。例如：李建华等[6]采用正交试验对黄栌漆黄素的煎煮工艺进行了优化，得到最佳提取方案：以25倍原料量的65%乙醇为提取溶媒，调pH至9，提取90 min，按此法得黄栌中漆黄素的提取率为1.03%；崔恩贤[17]通过试验确定了黄栌药用的有效部位，研究表明，黄栌根、枝、茎和叶中总黄酮含量呈上升趋势。基于此，文章采用超声辅助提取法，通过单因素试验和响应面优化，获得了黄栌中主要有效成分漆黄素的最佳提取工艺参数，此次研究有助于降低成本、提高有效成分提出率，也有利于更好地开发、利用黄栌的药用价值，提高其制剂质量及药效。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄栌叶（河南南阳，烘干粉碎后置阴凉干燥处备用）；漆黄素标准品（西安汇林生物科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，郑州派尼化学试剂厂）；甲醇、乙酸（分析纯，太仓沪试试剂有限公司）；丙酮（分析纯，衡阳市凯信化工试剂股份有限公司）；氢氧化钙（分析纯，广东光华科技股份有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

101A-2电热鼓风干燥箱、FW177中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；UV-5200紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；FA2014精密电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）；SB3200D超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、RE-1020旋转蒸发器、RE-201D恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

采用紫外分光光度法测定黄栌中漆黄素含量[18-19]。精密称取2.00 mg漆黄素标准品，用60%丙酮溶解，定容至100 mL容量瓶中。精确吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00和6.00 mL于10 mL容量瓶中，用60%丙酮定容至刻度，在最大吸收峰366 nm处测定其吸光度，所得数据经回归处理，得到标准曲线回归方程A=0.0759C-0.0273，相关系数为R2=0.9997。

1.3.2 漆黄素含量的测定

精确移取0.5 mL提取液于50 mL容量瓶中，用60%丙酮定容至刻度，在最大吸收波长366 nm处测吸光度，根据标准曲线，得漆黄素的浓度。漆黄素得率（%）按式（1）计算。

式中：C为试样质量浓度，μg/mL；V为提取液体积，mL；m为试样的质量，g。

1.3.3 单因素试验

分别以不同溶剂、丙酮体积分数、料液比、提取时间、提取次数为单因素进行试验，探讨其对黄栌叶漆黄素得率的影响。

准确称取5.0000 g黄栌叶粉，按料液比1∶10（g/mL）分别加入饱和石灰水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸，室温下浸泡2 h，超声处理20 min，抽滤，重复提取2次，合并滤液，按1.2.2小节方法测定其吸光度，计算漆黄素得率，重复3次。

准确称取5.0000 g黄栌叶粉，按料液比1∶10（g/mL）分别加入体积分数为20%，40%，60%，80%和100%的丙酮溶液，室温下浸泡2 h，超声处理20 min，抽滤，重复提取2次，合并滤液，按1.2.2小节方法测定其吸光度，计算漆黄素得率，重复3次。

准确称取5.0000 g黄栌叶粉，分别按料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14加入60%丙酮溶液，室温下浸泡2 h，超声处理20 min，抽滤，重复提取2次，合并滤液，按1.2.2小节方法测定其吸光度，计算漆黄素得率，重复3次。

准确称取5.0000 g黄栌叶粉，按料液比1∶10（g/mL）加入60%丙酮溶液，室温下浸泡2 h，分别超声处理10，20，30，40和50 min，抽滤，重复提取2次，合并滤液，按1.2.2小节方法测定其吸光度，计算漆黄素得率，重复3次。

准确称取5.0000 g黄栌叶粉，按料液比1∶10（g/mL）加入60%丙酮溶液，室温下浸泡2 h，超声处理40 min，抽滤，同样条件下分别超声处理1，2，3和4次，合并滤液，按1.2.2小节方法测定其吸光度，计算漆黄素得率，重复3次。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，选择丙酮体积分数、料液比、提取时间进行三因素三水平的中心组合试验，利用Design-Expert软件进行数据拟合，确定超声波提取黄栌叶漆黄素的最佳工艺参数，试验因素和水平见表1。

表1 三因素三水平中心组合试验因素水平编码表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 不同溶剂对漆黄素得率的影响

从表2可以看出：采用丙酮提取漆黄素的得率最高，达到1.6503%；饱和石灰水和乙酸所得漆黄素得率较低，均低于0.8000%，在提取中不宜采用；甲醇所得漆黄素得率与乙醇相当。这主要是因为漆黄素略溶于丙酮、甲醇、乙醇，几乎不溶于乙酸，而在碱性水溶液中其溶解度也偏小[8]。因此，从漆黄素得率方面考虑，后续试验均采用丙酮作为溶剂进行漆黄素的提取研究。

表2 不同提取溶剂对漆黄素得率的影响

2.1.2 丙酮体积分数对漆黄素得率的影响

由图1可以看出，开始时漆黄素得率随丙酮体积分数的增大而增加，当体积分数达到60%时，漆黄素得率最高（1.6503%），而当丙酮体积分数继续增加时，得率反而下降。这是由于丙酮体积分数较低时，水的含量相对较高，使漆黄素得率较低。当丙酮体积分数过高时，一些脂溶性物质的溶出量增大，使漆黄素的溶解度降低，从而导致漆黄素得率降低。因此，后续试验确定最适宜丙酮体积分数60%。

图1 丙酮体积分数对漆黄素得率的影响

2.1.3 料液比对漆黄素得率的影响

由图2可知，在其他条件一致的情况下，漆黄素得率随料液比的减小而增加，但当料液比低于1∶10（g/mL）时，黄栌叶漆黄素得率也开始降低。这是因为当扩散达到平衡时，增加提取剂用量不仅不会促进漆黄素的提取，反而为后面的工作带来困难。从提取效果和减少溶剂用量等方面综合考虑，后续试验采用料液比为1∶10（g/mL）。

图2 料液比对漆黄素得率的影响

2.1.4 提取时间对漆黄素得率的影响

由图3可知，黄栌叶漆黄素得率随提取时间的增加而增加，增加提取时间会使物质能更加充分地溶解，使颗粒中物质溶解完全，但40 min后提取率的增加相对较小，延长提取时间只会增加提取成本，为节约成本，后续试验宜选择40 min作为最适提取时间。

图3 提取时间对漆黄素得率的影响

2.1.5 提取次数对漆黄素得率的影响

由图4可知，随着提取次数的增加，漆黄素得率也增加。提取2次即可达到较好的效果，3次提取与2次提取的得率相比变化不明显，从经济与操作方面考虑，后续试验选择2次为最适提取次数。

图4 提取次数对漆黄素得率的影响

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 回归模型的建立与分析

根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，结合单因素试验的结果，选取丙酮体积分数、料液比、提取时间进行三因素三水平中心组合试验，利用响应面法优化黄栌叶漆黄素提取工艺参数，试验方案与结果见表3。

表3 三因素三水平中心组合试验方案及结果

用Desingn-Expert软件对表3数据进行回归分析，结果见表4。对各因素回归拟合后，得到黄栌叶漆黄素得率Y对X1，X2和X3的二次多项回归方程：

表4 回归系数显著性检验表

从表4可以看出：料液比、提取时间的一次项和二次项对漆黄素得率的影响极显著或高度显著；丙酮体积分数的二次项对漆黄素得率的影响极显著，而一次项不显著。表明试验因素对响应值不是简单的线性关系，而是一种非线性关系。回归方差分析显著性检验结果表明，该模型回归高度显著，且失拟项不显著，说明该方程对试验拟合较好，可以用此模型来分析和预测超声波法辅助提取黄栌叶漆黄素的工艺条件。

2.2.2 响应面分析与优化

响应曲面反映了当丙酮体积分数、料液比、提取时间三个因素的任意变量取零点水平时，其他两个因素的交互作用对黄栌叶漆黄素得率的影响情况。曲面陡表明该因素对提取率的影响显著，曲面平缓表明该因素对提取率的影响不显著；等高线的形状反映两因素交互作用的强弱，椭圆形表明交互作用强，影响显著，圆形则相反；等高线密集表明对提取率影响较大，稀疏表明影响较小。

图5～图7直观地反映了各因素对响应值的影响，通过比较该3组图可知：提取时间（X3）对漆黄素得率的影响最为显著，表现为曲线较陡；而丙酮体积分数（X1）与料液比（X2）次之，表现为曲线较为平滑，3组图的等高线均为圆形，说明各因素的交互作用较弱，对漆黄素得率的影响不显著。

图5 丙酮体积分数与料液比的交互作用对漆黄素得率的影响

图6 丙酮体积分数与提取时间的交互作用对漆黄素得率的影响

图7 料液比与提取时间的交互作用对漆黄素得率的影响

2.3 黄栌叶漆黄素最佳提取条件的确定和验证试验

根据所得到的模型，可预测在稳定状态下的最优工艺条件，即丙酮体积分数61.73%、料液比1∶10.37（g/mL）、提取时间44.23 min。在此条件下漆黄素得率理论上可达1.9513%。考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为乙醇体积分数60%、料液比1∶10（g/mL）、提取时间44 min，在此条件下进行3次平行试验，实际平均值为1.9482%，与预测值偏差较小，说明该回归方程与实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面法优化所得的超声波辅助提取工艺参数准确可靠。

3 结论

研究以漆黄素得率为指标，通过单因素试验和响应面法优化试验，获得了超声波辅助法提取黄栌叶漆黄素的最佳工艺和条件：丙酮体积分数60%，料液比1∶10（g/mL），提取时间44 min，重复次数2次，在该工艺条件下黄栌叶中漆黄素得率为1.9482%。研究结果为漆黄素的进一步应用提供了一定的理论基础和参考。