洋葱槲皮素对免疫抑制小鼠免疫调节作用的影响

倪湾，高硕

锦州医科大学医疗学院（锦州 121013）

洋葱为百合科葱植物，原产地亚洲西部，在我国分布范围十分广阔，栽培历史悠久，四季皆有。因其内部细嫩，生吃味道微辣较甜，熟吃软嫩可口，味质极佳，被誉为“菜中皇后”“心脏支架”。洋葱资源丰富，营养价值较高，富含槲皮素和前列腺素A等营养物质，使洋葱具有很多其他食物不可取代的健康功效，在降血脂[1]、抗动脉硬化作用[2]、预防恶性肿瘤[3]及降血糖[4]等方面均具有较强药理作用。同时，洋葱也是药食两用上等补品，具有杀菌抗寒，预防感冒的功效，辛辣的气味还可以促进肠胃消化腺分泌，增进食欲，甚至可以有效控制“三高”，因此洋葱常作为功能性食品原料用于生产抗氧化及预防心脑血管疾病保健食品[5]。由于其具有独特的营养价值，近年来国内外市场对洋葱的需要量逐渐增多，并将以其药食同源的独特风格进入国际市场。

洋葱槲皮素（OQE），是从洋葱表皮部位提取分离纯化得到的一种天然黄酮类化合物，有研究表明洋葱富含的类黄酮物质可使血小板的黏稠度下降，经常食用洋葱可以预防血栓类疾病，同时可以减少降低心梗和脑血栓的发生率[6]。根据现代研究发现，洋葱槲皮素具有抗肿瘤[7]、抗氧化[8]、预防骨质疏松[9]、保护心脑血管[10]、抗肥胖作用[11]等功效。

随着生活水平的提高及科技的进步，对洋葱槲皮素在降血脂、抗肿瘤及抗氧化功能方面的研究报道越来越多，但其免疫调节活性尚未得到广泛研究。OQE毒性小，不良反应少，所以有望开发成作为药食同源的保健食品原材料，因此其需求量将越来越多。免疫力是指机体抵抗外来侵袭，维护体内环境稳定性的能力，免疫系统是人体健康的基石[12]。新冠病毒的暴发打破人们的传统生活方式，“阳康”之后的人群普遍免疫力降低，因此增强机体免疫力十分关键，增强免疫力的保健食品也受到关注和欢迎。为在临床及开发新的功能食品方面的广泛应用，对洋葱抗氧化、抗炎、增强免疫力等方面的研究仍是研究重点，因此，为更深入探讨其免疫活性，对OQE的更进一步开发和加强其保健功能及药用价值的利用具有重要意义。

为探讨OQE的免疫调节活性，试验以环磷酰胺（CY）免疫损伤小鼠为模型，探讨OQE对小鼠免疫及抗氧化能力的影响。试验采用MTT法观察OQE体内对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，采用ELISA法观察OQE对免疫抑制小鼠淋巴细胞中IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ分泌的影响，采用q-PCR检测OQE对免疫抑制小鼠淋巴细胞IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γmRNA表达水平的影响，旨在明确OQE提高机体免疫力的作用，为OQE的进一步开发功能食品和临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

Balb/c小鼠[SPF级，体重20±2 g，6～8周龄，锦州医科大学生命科学院，生产许可证号SCXK（辽）2014-0004]；OQE（纯度≥98%，MUST-12062610，西安天瑞生物技术有限公司）；新生牛血清、甲基噻唑蓝（MTT）、台盼蓝、RPMI-1640培养基、二甲基亚砜（DMSO）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）和磷酸盐缓冲溶液（PBS），碧云天生物技术有限公司；小鼠IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ细胞因子检测试剂盒（武汉博士德公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物和试验设计

将50只小鼠分成5组，每组10只。正常组（NC）和环磷酰胺组（CY）灌胃生理盐水，灌胃14 d。洋葱槲皮素低剂量组（CY+OQL）、中剂量组（CY+OQM）、高剂量组（CY+OQH）分别给予50，100和200 mg/kg的洋葱槲皮素，灌胃14 d。CY、CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH分别于第1～第3天腹腔注射CY（100 mg/kg），NC按相同方法注射生理盐水。最后一次灌胃后24 h处死小鼠。所有动物试验均按照锦州医科大学医疗学院伦理委员会和实验动物中心的规程进行，并按照当地伦理指南进行。

1.2.2 淋巴细胞悬液制备

参考王平等[13]试验方法，小鼠用颈椎脱臼法处死，用75%酒精浸泡3 min消毒，将取出的各组脾脏分离放入超净无菌工作台，放入PBS中捣碎，用0.0750 mm（200目）的细胞筛进行过滤，加入红细胞裂解液裂解红细胞，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，制成淋巴细胞悬液，在37 ℃ 5% CO2培养箱中进行培养。

1.2.3 MTT法检测免疫抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖

按1.2.1试验分组及处理各浓度组后检测免疫抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖情况，将淋巴细胞接种于96孔板中（5×106细胞/mL），每组均设5复孔，每孔加入100 μL淋巴细胞悬液。在37 ℃ 5% CO2培养箱中培养48 h。每孔加入20 μL MTT（5 μg/mL），继续培养4 h，弃去上清液，加入DMSO 150 μL，用酶标仪测量波长为570 nm的吸光度。结果以增殖指数（PI）反映小鼠脾淋巴细胞增殖率，按式（1）计算。

1.2.4 ELISA法检测细胞因子的分泌

按1.2.1试验分组及处理各浓度组后检测免疫抑制小鼠脾淋巴细胞因子的分泌情况，将1 mL淋巴细胞接种于12孔板中（5×106细胞/mL），每组均设5复孔，在37 ℃ 5% CO2环境下培养48 h后，按1500 r/min 4 ℃离心5 min，收集上清液。根据试剂盒说明书检测脾淋巴细胞IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的分泌，用酶标仪进行测量。

1.2.5 q-PCR法检测mRNA表达量

小鼠将脾细胞在37 ℃ 5% CO2环境下培养48 h。使用Trizol法从培养后的脾淋巴细胞提取RNA，并根据Takara逆转录试剂盒说明书进行cDNA合成，合成条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。采用Eppendorf AG 22331机器（Hamburg，Germany）和Takara反转录PCR说明书进行实时荧光定量PCR，定制引物见表1。实时荧光PCR反应条件为95 ℃ 30 s，在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s下进行40个循环。采用2-ΔΔCt方法进行数据分析以得到目的基因的表达量。

表1 PCR引物设计

1.2.6 统计学分析

各组数据以“平均数±标准差”表示。应用SPSS 22.0数据分析软件对试验结果进行统计学分析，数值以“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，以Tukey法进行显著性检验，检验水准P=0.05。

2 结果与分析

2.1 洋葱槲皮素对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖的影响

由图1可知：与空白组相比，环磷酰胺组淋巴细胞指数显著降低（P＜0.05），差异具有统计学意义（P＜0.05），表明免疫低下模型构建成功；CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH组淋巴细胞指数呈现上升趋势（P＜0.05），说明OQE能够刺激淋巴细胞增殖；OQE浓度50～200 mg/kg浓度范围时，淋巴细胞增殖指数随OQE浓度升高出现显著上升趋势，表现出一种剂量依赖关系，并且组间差异显著（P＜0.05）。由此可以说明，OQE对小鼠淋巴细胞增殖呈现正向调节作用，并且各组间均存在统计学意义（P＜0.05）。

图1 洋葱槲皮素对淋巴细胞增殖的影响（x±s，n=5）

2.2 洋葱槲皮素对免疫抑制小鼠淋巴细胞因子分泌的影响

由图2～图5可知：与空白组相比，IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的CY组分泌量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与空白组相比，CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH组中细胞因子分泌量呈现升高趋势，说明OQE能够诱导细胞因子分泌；洋葱槲皮素浓度50～200 mg/kg范围时，CY+OQH组小鼠IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的分泌量均高于CY+OQL组，随着OQE浓度的升高呈现上升趋势；结果表明200 mg/kg OQE对改善免疫低下小鼠免疫活性分子水平效果较好。由此提示OQE处理对免疫低下小鼠的免疫功能具有提高作用。

图2 OQE对淋巴细胞IL-2分泌的影响

图3 OQE对淋巴细胞IL-6分泌的影响

图4 OQE对淋巴细胞IL-12分泌的影响

图5 OQE对淋巴细胞IFN-γ分泌的影响

2.3 洋葱槲皮素对淋巴细胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ mRNA的影响

由图6～图9可知：与空白组相比，IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γCY组的mRNA表达量显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与空白组相比，CY+OQL、CY+OQM、CY+OQH组中细胞因子mRNA表达量呈现升高趋势，说明OQE能够诱导mRNA的表达；OQE浓度在50～200 mg/kg范围时，CY+OQH组小鼠IL-2、IL-6、IL-12、IFN-γ的mRNA表达量均高于CY+OQL组，随着OQE浓度的升高呈现上升趋势；由此结果显示洋葱槲皮素可使免疫低下小鼠部分免疫细胞核转录因子的表达水平得以改善，与2.2所得结果相一致。

图6 OQE对淋巴细胞IL-2 mRNA的影响

图7 OQE对淋巴细胞IL-6 mRNA的影响

图8 OQE对淋巴细胞IL-12 mRNA的影响

图9 OQE对淋巴细胞IFN-γ mRNA的影响

3 讨论

3.1 洋葱槲皮素对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖的影响

免疫低下通常表现体内免疫功能异常，并且可以导致机体容易感染或发生免疫性疾病。试验表明：洋葱槲皮素浓度在50～200 mg/kg范围内，其对小鼠淋巴细胞体内增殖具有促进作用；OQE浓度200 mg/kg时效果最佳，与CY组差异显著，有效提高小鼠淋巴细胞增殖的能力。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，是淋巴细胞居留增殖的场所，淋巴细胞作为机体免疫系统的主要细胞群体，产生特异性免疫应答，因此脾脏的免疫功能的正常发挥与其生长发育和组织结构有着密切关系[14]。因此，可以说脾脏生长发育的情况和脾脏里淋巴细胞的增殖和凋亡紧密相关。试验中，OQE可使免疫抑制小鼠的淋巴细胞显著提升，在免疫应答过程中淋巴细胞增殖产生效应淋巴细胞，这些免疫活性细胞接受抗原刺激后，共同完成对抗原物质的识别、应答、清除，进行特异性免疫应答，互相协调制约，从而达到机体内环境稳定，并发挥免疫调节功能。淋巴细胞增殖情况反映机体免疫应答反应的强度，体现机体的细胞免疫状态。但对OQE免疫活性的调节作用尚不明确，还有待进行更深入研究。

3.2 洋葱槲皮素对免疫抑制小鼠淋巴细胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ分泌及mRNA的影响

淋巴细胞在机体免疫应答过程中发挥重要作用，淋巴细胞的增殖效果可作为评估动物的免疫反应能力的最有力的指标[15]。细胞因子在维持体内平衡及先天和适应性免疫反应当中发挥重要作用，而失调的细胞因子则会对人体产生一些影响，如导致慢性炎症、过敏反应、肥胖、糖尿病、高血压等疾病[16]。因此，需调节体内细胞因子的产生，使得体内特定的细胞群体间互相协调，维持正常生理平衡。试验判断OQE对免疫抑制小鼠淋巴细胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ均有不同程度的诱导分泌作用，调节失调的细胞因子，维持平衡。

细胞因子之间往往是一个十分复杂的网络系统，它们之间的相互作用可以调节机体生理平衡，从而达到相应的细胞应答水平。IL-2具有促进T淋巴细胞分化和增殖的作用，促进B淋巴细胞的生长和发育，增强B淋巴细胞的增殖及抗体分泌[17]。IFN-γ是一种由Th1和NK细胞响应IL-12产生的细胞因子，可促进Th1免疫反应的进行和巨噬细胞的活化，在许多细胞系统中具有与Th2型细胞因子拮抗的生物学功能[18]。IFN-γ具有抗病毒[19]、免疫调节及抗肿瘤特性[20]。在免疫反应中，IL-12主要作用于淋巴细胞，是Th1细胞免疫应答的决定因素。IL-6是由多种由免疫细胞和非免疫细胞产生，具有多效性，且IL-6在多种细胞类型的分化中发挥重要作用，可以增强免疫反应[21]。免疫系统之间的纽带发挥核心作用因此，试验观察OQE对IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ细胞因子的分泌和mRNA表达的影响判断免疫活性。综上可见，试验中不同浓度OQE处理可在不同程度上促进淋巴细胞IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ的分泌和上调mRNA表达，进一步调节免疫活性。

4 结论

OQE在体内调节免疫抑制小鼠淋巴细胞免疫活性中起着重要作用，洋葱槲皮素在50～200 mg/kg浓度范围内，免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖显著增加，通过促进IL-2、IL-6、IL-12和IFN-γ细胞因子的分泌，上调mRNA表达量实现免疫活性的提高，从而提高机体免疫功能，维持生理平衡和人类的健康，为利用OQE开发增强免疫功能的产品提供研究基础。