蛋白酶种类对牡蛎酶解液挥发性风味成分的影响研究

罗一颖，奚艺珺，唐海霞，彭惠意，陈雪认，杨昭

1.广东食品药品职业学院食品学院（广州 510520）；2.韩山师范学院生命科学与食品工程学院（潮州 521041）

牡蛎（Crassostrea gigas）是一种优质的海水养殖贝类。2020年我国牡蛎产量达542.46万 t，占我国海洋养殖贝类总量的36.65%[1]。鉴于牡蛎的高营养价值与高产量，牡蛎的应用与研究逐年增多。大量研究表明牡蛎酶解产物具有多种生理活性和加工适用性，是制备高品质调味品的重要基础风味物质[2-3]。风味是牡蛎酶解产物的重要感官品质，是其加工适用性的重要限制性因素。挥发性风味成分是人类感官嗅闻能够感知的化合物，对酶解产物风味有重要影响。研究者围绕牡蛎酶解过程挥发性风味成分的变化进行大量研究。邓嫣容[4]采用溶剂萃取法直接进样，利用气相色谱质谱联用仪从复合蛋白酶牡蛎酶解液中鉴定出20种化合物。刘晓丽等[5]采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法从木瓜蛋白酶和中性蛋白酶牡蛎酶解液中分别鉴定出60和62种化合物。苏明月等[6]采用电子鼻和顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用法从碱性蛋白酶0，1和3 h牡蛎酶解液中分别鉴定出化合物31，32和36种。在前期研究过程中，采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法从复合蛋白酶0.5，1.0，4.0和8.0 h牡蛎酶解液中分别鉴定出化合物51，52，60和51种。蛋白质酶解是复杂的过程，受蛋白酶种类、底物种类、反应条件等多种因素影响。动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶为水产品酶解常用蛋白酶，鲜有研究者关注其对牡蛎酶解液挥发性风味成分的影响。

因此，为探究常见蛋白酶种类对牡蛎酶解液风味品质的影响，采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法对不同蛋白酶牡蛎酶解液的挥发性风味成分进行分析鉴定，以期为高品质牡蛎酶解液开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

近江牡蛎肉（购于广东饶平，购回实验室后迅速用超纯水清洗，用塑料袋包装为1 kg/袋，置于-18 ℃冰箱冻存备用）；动物蛋白酶（4000 U/g，食品级，宏景生物科技有限公司）；风味蛋白酶（500 LAPU/g，食品级，诺维信中国公司）；碱性蛋白酶（20万U/g，食品级，河南万邦实业有限公司）；中性蛋白酶（20万 U/g，食品级，河南万邦实业有限公司）；胰蛋白酶（4000 U/g，食品级，河南万邦实业有限公司）；盐酸、氢氧化钠（分析纯，上海阿拉丁生化技术股份有限公司）。

1.2 仪器和设备

KS-1053多功能料理机（广州市祈和电器有限公司）；H1850R离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；DKZ-3B电热恒温振荡水槽（上海一恒科学仪器有限公司）；BSA2202S型电子天平[精度10 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；ATX224型分析天平[精度0.1 mg，岛津仪器（苏州）有限公司]；GCMS-QP2010 ultra气相色谱质谱联用仪（日本岛津制作所）；50 μm二乙苯基/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷手动固相微萃取（Solid phase microextraction，SPME）进样手柄和手动固相微萃取头（美国Supelco公司）；Rts-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Restek公司）；FE22-Standard pH计[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]。

1.3 牡蛎酶解液制备

参考杨昭等[7]的方法，略微调整。取冻藏袋装近江牡蛎肉置于流动水中解冻，解冻后的牡蛎肉加入等质量的去离子水，制成匀浆。采用0.05 mol/L盐酸溶液或0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节匀浆pH至蛋白酶最佳反应pH，加入相应质量的蛋白酶，置于摇床中振荡酶解，每隔1 h用0.05 mol/L盐酸溶液或0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至蛋白酶最佳反应pH。酶解结束后采用沸水浴20 min进行灭酶，降温后在4 ℃，6793×g条件下离心20 min，收集上清液为牡蛎酶解液，-18 ℃保存备用。按照表1酶解条件制备不同蛋白酶牡蛎酶解液。

表1 蛋白酶的酶解条件

1.4 挥发性风味成分分析

1.4.1 挥发性风味成分提取

冻藏牡蛎酶解液置于室温下解冻30 min后，称取3.0 g解冻的牡蛎酶解液放入萃取瓶。萃取瓶置于55 ℃下平衡10 min，插入已老化的DVB/CAR/PDMS萃取头吸附1 h后拔出，用于GC-MS检测[8]。

1.4.2 挥发性风味成分鉴定

挥发性成分参照文献[8]测定。色谱柱条件：Rts-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。进样条件：高纯度氦气（99.999%）以0.8 mL/min速度流入，输送管路温度230 ℃。解吸温度230 ℃，解吸时间5 min。升温程序：初始温度35 ℃（维持2 min），以4 ℃/min的速率升温至40 ℃（维持2 min），以5 ℃/min的速率升温至100 ℃（维持10 min），继续以10℃/min的速率升温至230 ℃。质谱条件：电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，扫描范围m/z35～500。

1.4.3 挥发性风味成分定性分析

通过NIST11质谱库对检测出的各化合物进行对比检索，保留相似度大于80%的化合物。结合相关文献对检索的化合物定性，以面积归一化法确定各挥发性风味成分的相对含量，仅统计相对含量≥0.1%的化合物[9]。

1.5 数据处理

每个试验重复3次，数据用平均值±标准差表示。采用Microsoft Excel 2016进行作图和数据分析。

2 结果及分析

2.1 5种牡蛎酶解液的总离子流图

动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5种牡蛎酶解液挥发性风味成分的总离子流图如图1～图5所示。从整体上看，挥发性风味成分的总离子流色谱图的分离度较好，挥发性风味成分的出峰时间主要集中在10～15 min和35～40 min。刘晓丽等[5]采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法鉴定木瓜蛋白酶和中性蛋白酶牡蛎酶解液时，挥发性风味成分的出峰时间主要集中在15～20 min与试验第1个集中出峰时间一致，但试验在35～40 min也获得大量挥发性成分。原因可能是刘晓丽等[5]采用的是PDMS萃取头，试验采用的是DVB/CAR/PDMS萃取头。由于萃取头上的涂层种类不同，会导致对挥发性成分的吸附量存在的差异，最终引起检测成分种类和含量的差异。DVB/CAR/PDMS可以特征性吸附多种挥发性成分，近年来被广泛应用于牡蛎挥发性成分的富集[10-11]。同时，从总离子流色谱图上也可以看出5种牡蛎酶解液中各挥发性风味成分的丰度差异。丰度可直观反映成分的含量，丰度越大，含量越大。总体来看，胰性蛋白酶牡蛎酶解液中主要挥发性成分的含量较高。

图3 碱性蛋白酶牡蛎酶解液的总离子流图

图4 胰性蛋白酶牡蛎酶解液的总离子流图

图5 中性蛋白酶牡蛎酶解液的总离子流图

2.2 5种牡蛎酶解液的挥发性风味成分种类和含量分析

由表2和表3可知，5种蛋白酶牡蛎酶解液共鉴定出化合物45种，其中醇类6种、酚类1种、醛类12种、烃类10种、酮类9种、杂环类4种、酯类3种。动物蛋白酶牡蛎酶解液中鉴定出化合物22种，其中含有2种醇类（21.82%）、1种酚类（0.26%）、7种醛类（34.21%）、5种烃类（2.85%）、3种酮类（25.47%）、1种杂环类（0.24%）、3种酯类（1.91%）。风味蛋白酶牡蛎酶解液中鉴定出化合物19种，其中2种醇类（15.18%）、6种醛类（22.29%）、5种烃类（4.62%）、5种酮类（26.44%）、1种酯类（0.60%）。碱性蛋白酶牡蛎酶解液中鉴定出化合物19种，其中2种醇类（20.92%）、8种醛类（39.43%）、2种烃类（1.45%）、4种酮类（22.83%）、1种杂环类（0.78%）、2种酯类（0.84%）。胰蛋白酶牡蛎酶解液中鉴定出化合物19种，其中3种醇类（22.48%）、7种醛类（35.59%）、4种烃类（2.00%）、3种酮类（27.48%）、1种杂环类（0.22%）、1种酯类（0.40%）。中性蛋白酶牡蛎酶解液中鉴定出22种化合物，其中2种醇类（19.58%）、9种醛类（32.72%）、4种烃类（2.28%）、2种酮类（27.76%）、2种杂环类（0.63%）、3种酯类（1.34%）。

表2 牡蛎酶解液挥发性风味成分的相对含量

表3 牡蛎酶解液挥发性风味成分的种类和数量

在鉴定的7种化合物中，醛类、醇类、酮类、酯类化合物的阈值相对较低，对气味贡献较大。为探究蛋白酶种类对牡蛎酶解液挥发性风味成分的影响，对鉴定的牡蛎酶解液挥发性风味成分进行分析。

醛类物质为脂肪氧化的主要产物，对水产品风味影响较大[12-13]。研究表明醛类物质是导致腥味存在的因素之一，即便在含量极少的情况下，由于其有叠加效应亦会对风味产生影响[14]。被检出的12种醛类物质中，2-己烯醛具有青草香气，反-顺-2,6-壬二烯醛具有强烈的紫罗兰和黄瓜似香气[15]。这2种化合物在动物蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶3种牡蛎酶解液中均存在，2-己烯醛相对含量相对较低，是潜在风味化合物，反-顺-2,6-壬二烯醛则被认为是牡蛎肉中关键的挥发性风味物质[16]。癸醛具有海味、十四醛具有强烈桃子似香气、十二醛呈现脂肪香和瓜果香[8,14,17]，几种化合物均呈现令人愉快的气味。苯甲醛呈现出焦糖类似味和苦味，辛醛和壬醛在5种酶解液中均被检出，辛醛具有鱼腥味，壬醛为油酸和亚油酸氧化后的产物，呈塑料味和腥味[18-20]。苏国万等[15]研究表明，壬醛为牡蛎酶解液中的关键挥发性风味化合物之一。张梅超[21]发现壬醛是牡蛎酶解液中腥臭味、哈喇味的主要物质之一。试验中壬醛为5种牡蛎酶解液中含量最高的醛类，在动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5种酶解液中相对含量分别为4.74%，6.13%，3.42%，2.86%和4.09%。

醇类化合物多数由酯类进行氧化分解后得来，或是羰基化合物进行还原反应后产生[20]。其中：饱和醇类阈值较高，对风味影响较小；不饱和醇类阈值较低，对风味影响较大，其一般表现为蘑菇味、金属味，亦是形成牡蛎风味重要物质之一[16,21]。1-辛烯-3-醇为5种酶解液中含量最多的挥发性成分，其为花生四烯酸氧化降解的产物，主要贡献出牡蛎中特有的类似蘑菇的香气,但有土腥味，1-辛烯-3-醇亦是牡蛎酶解液中关键的风味化合物之一[24,14]。其在动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5种酶解液中相对含量分别为20.34%，14.38%，14.98%，21.24%和19.38%。

酮类可能由脂肪酸氧化、降解和氨基酸降解产生，对腥味有一定增强作用[15]。2-壬酮呈现水果、花、油脂和药草似香气，是鲜活牡蛎中的鲜味的主要化合物[25]。但5种牡蛎酶解液中检测出的酮类物质数量较少、含量较低。在5种酶解液中未发现共有的酮类化合物，只有3-癸烯-2-酮在风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶3种酶解液中存在。

酯类物质由醇和羧酸通过酯化反应生成，一般来说与美拉德反应有关，有部分可能由于酶解过程中加热灭酶这一步骤而产生，一般具有显著香味特征，主要呈现出愉悦性气味如花香、甜香、青草香、奶油香、水果香等[11,26-27]。研究表明其是新鲜牡蛎中鲜香气味的主要来源，但在5种牡蛎酶解液中含有的酯类化合物种类较少，相对含量也较低[28]。动物蛋白酶牡蛎酶解液中的1,2-苯二甲酸双（2-甲基丙基）酯相对含量为1.06%，为5种牡蛎酶解液中相对含量最高的酯类化合物。

烃类化合物是来自脂肪酸烷氧基的均裂，其大多数呈现较为愉快的风味，如甜香味，以具有支链的烷烃为典例，亦有研究提出烃类化合物对于提高牡蛎整体风味有一定作用[29-30]。但由于烃类化合物整体阈值相对较高，且检出的10种烃类化合物相对含量都较低，对酶解液的风味造成的影响有限[31]。

2.3 5种牡蛎酶解液独有的挥发性风味成分分析

独有的挥发性风味成分可能是某种蛋白酶酶解液的特征性风味成分，对评估牡蛎酶解液的风味有重要影响。2,4-二叔丁基苯酚、二十六烷、植酮为动物蛋白酶解液中独有的挥发性风味成分，其中2,4-二叔丁基苯酚具有特殊烷基酚气味。异胡薄荷醇、2-甲基二十四烷、5-叔丁基-环庚烯、6-甲基-2庚酮、2-乙基己酰氯、反式香叶基丙酮为风味蛋白酶解液中独有的挥发性风味成分，其中异胡薄荷醇具有薄荷香气。乙酸-1-降莰烷甲醇、十二醛、2-壬酮、2,5-二甲基吡嗪为碱性蛋白酶解液中独有的挥发性风味成分，其中十二醛具有强烈的脂肪香气。2-乙基-1-己醇、二十一烷为胰蛋白酶解液中独有的挥发性风味成分。十六醇、6-甲基-3-辛炔、2,6,10,14-四甲基-十六烷、1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸（2-吗啉-4-基乙基）-酰胺、吡嗪，3-乙基-2,5-二甲基为中性蛋白酶解液中独有的挥发性风味成分。

3 结论

通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用法探讨5种蛋白酶对牡蛎酶解液挥发性风味成分的影响。从5种蛋白酶牡蛎酶解液中共鉴定出化合物45种，其中醇类6种、酚类1种、醛类12种、烃类10种、酮类9种、杂环类4种、酯类3种。动物蛋白酶牡蛎酶解液和中性蛋白酶牡蛎酶解液中鉴定出化合物22种，风味蛋白酶牡蛎酶解液、碱性蛋白酶牡蛎酶解液和胰蛋白酶牡蛎酶解液中各鉴定出19种化合物。醛类和醇类化合物对水产品的风味影响较大。从动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶5种牡蛎酶解液中分别鉴定出7,6,8,7和9种醛类化合物，分别鉴定出2,2,2,3和2种醇类化合物。试验结果可为高品质牡蛎酶解液的开发奠定理论基础，也为后期牡蛎酶解过程中风味变化机制和关键风味产生途径研究提供参考。