不同产地黄芪质量及其储藏对成分的影响

李强，吴涛，石榴花，殷涛，王冰清，胡力飞,3

1.劲牌有限公司（黄石 435100）；2.劲牌持正堂药业有限公司（黄石 435100）；3.湖北工业大学生物工程与食品学院（武汉 430068）

黄芪为豆科植物（Leguminosae）蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，为我国常用的传统中药材，以“黄耆”之名始载于《神农本草经》，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效[1-2]。黄芪可作为保健食品原料使用，在我国有作为食品原料的食用历史，并于2019年11月开始作为9种试点按照传统既是食品又是中药材的物质之一。黄芪中的化学成分主要为皂苷、黄酮和多糖类成分，现代研究表明，黄芪具有提高免疫力[3]、抗肿瘤[4-5]、降血糖[6-7]、降尿酸[8]、抗炎[9]、抗氧化[10-12]、抗疲劳[13-14]等药理作用。

试验主要对甘肃省定西市、陇南市及内蒙古包头市共22批黄芪药材进行质量评价，根据含量、总灰分、二氧化硫残留、浸出物、重金属对不同产地的原料进行聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘分析，并对储存4年后的药材黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷成分含量进行比较分析，以期为黄芪的产地选择、储存及产品开发提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

UltiMate 3000高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；Alltech ELSD 6000（美国奥泰公司）；Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱[安捷伦科技（中国）有限公司]；Sepax Amethyst C18-H色谱柱（美国赛分有限公司）；ICAP RQ电感耦合等离子体质谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；XS-105DU电子分析天平（梅特勒托利多科技有限公司）；SK8200LHC超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；PHOENIX马弗炉（美国CEM公司）；101-2 AB电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；DFY-500 C摇摆式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；药典筛（浙江上虞五四纱筛厂）。

黄芪甲苷（批号110781-201717，96.90%；批号110781-202118，96.80%；中国食品药品检定研究院）；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201606，97.60%；111920-201907，96.80%；中国食品药品检定研究院）；乙腈（色谱级，美国Fisher chemical公司）；甲酸（色谱级，美国Fisher chemical公司）；水为超纯水，其余试剂为分析纯。

22批不同产地黄芪药材，由劲牌持正堂药业有限公司采集，经鉴定为豆科植物（Leguminosae）蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，药材产地信息见表1。

表1 黄芪样品产地信息

1.2 试验方法

1.2.1 水分测定

取约2 g通过2号药典筛（筛孔内径0.850 mm）的黄芪粉末，根据《中国药典》通则水分测定法第二法测定，并计算供试品中的含水量（%）。

1.2.2 含量测定

采用《中国药典》2015版及2020版黄芪项下要求进行黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定[1,15]，其中黄芪甲苷测定所用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm），毛蕊异黄酮葡萄糖苷测定所用色谱柱为Sepax Amethyst C18-H（250 mm×4.6 mm，5 μm）。黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品及各批次药材色谱图如图1所示。

图1 22批黄芪样品及对照品HPLC色谱图

所有供试品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量均以干燥品计。供试品含量按以下式（1）计算：

1.2.3 总灰分测定

取约2.5 g通过2号药典筛的黄芪粉末，根据《中国药典》通则灰分测定法要求进行总灰分测定。

1.2.4 重金属及有害元素测定

取约0.5 g通过2号药典筛的黄芪粉末，按照《中国药典》铅、镉、砷、汞、铜测定法（通则电感耦合等离子体质谱法）采用ICAP RQ电感耦合等离子体质谱仪测定。

1.2.5 二氧化硫的测定

取约10 g黄芪药材细粉，根据《中国药典》通则二氧化硫残留量测定法中第一法（酸碱滴定法）要求进行供试品二氧化硫残留量测定。

1.2.6 有机氯类农药残留量

取2 g通过3号药典筛（筛孔内径0.355 mm）的黄芪粉末约，采用《中国药典》农药残留量测定法第一法（其他有机氯类农药残留量测定法）测定。

1.2.7 浸出物的测定

取2～4 g通过2号药典筛的黄芪粉末，根据《中国药典》通则浸出物测定法中冷浸法要求进行浸出物含量测定。

2 结果与分析

2.1 含量测定方法学确认

分别对《中药药典》2015版及2020版黄芪项下黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷开展方法学确认，结果表明测定方法重复性均≤2.8%，中间精密度均≤2.7%，平均回收率均在98%～103%之间，表明仪器方法的精密度及方法的重复性较好，检测方法适宜性较好。

2.2 黄芪样品测定结果

试验按照《中国药典》2015版黄芪项下要求对黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、水分、总灰分、二氧化硫残留量、重金属、有机氯类农药残留量及浸出物进行测定，根据检测结果，22批黄芪样品中二氧化硫残留量均未检出，有机氯类农药残留量均符合要求，其他指标含量存在差异，各项指标检测数据见表2。

表2 22批黄芪样品检测结果

2.3 聚类分析（CA）

以黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、总灰分、浸出物和5个重金属指标作为变量，采用Origin Pro 2023软件以ward聚类方法结合Euclidean Distance距离计算对22批黄芪样品进行聚类分析，以ward聚类方法结合Pearson相关性对9个指标变量进行聚类分析，聚类分析结果见图2。结果表明：判定距离为6时，黄芪样品可被分为4类，其中定西市与陇南市相邻的2个产地样本被分为3类，主要与黄芪甲苷、铅、砷3个变量有关；内蒙古包头市样本（S18～S22）聚为1类。9个变量分别聚为4类，黄芪甲苷与铜聚为1类，总灰分与铅、砷、镉聚为1类，浸出物与汞聚为1类，毛蕊异黄酮葡萄糖苷为1类。从聚类热图中可见，黄芪原料分类与各变量之间有一定相关性，可能与各种植地区的气候、土壤等因素有关。

图2 22批黄芪样本聚类分析热图

2.4 主成分分析（PCA）

采用Origin Pro 2023软件对黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、总灰分、浸出物和5个重金属指标进行主成分分析，计算相关矩阵的特征值、特征向量和分值。确定特征值＞1的4个主成分，4个主成分的累计方差贡献率为81.52%，相关矩阵的特征值所作碎石图见图3。第1主成分（PC1）解释总方差的34.55%，信息主要来自于砷、铅和总灰分且均呈正相关；第2主成分（PC2）解释总方差的17.18%，信息主要来自于铜、毛蕊异黄酮葡萄糖苷，与铜呈正相关，与毛蕊异黄酮葡萄糖苷呈负相关；第3主成分（PC3）解释总方差的15.77%，信息主要来自于镉、黄芪甲苷和浸出物，与镉和浸出物呈正相关，与黄芪甲苷呈负相关；第4主成分来（PC4）解释总方差的14.02%，信息主要来自于汞和总灰分且均呈正相关。以PC1、PC2、PC3绘制22批次黄芪样本的双标图见图4，其中内蒙古包头市样本空间分布较为集中，甘肃省定西市、陇南市2个地域相近的样本也分布比较相近，两省/自治区的样本能很好区分，且各样本主成分得分和特征向量的分布情况均与聚类分析结果相近。

图3 主成分分析碎石图

图4 主成分分析双标图

2.5 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

采用SIMCA14.1软件对黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、总灰分、浸出物和5个重金属指标进行OPLS-DA分析，结果表明，通过OPLS-DA可实现对甘肃和内蒙古两省黄芪的有效区分，分析中的自变量拟合指数（R2X）为0.692，因变量拟合指数（R2Y）为0.848，模型预测指数（Q2）为0.535，R2和Q2均超过0.5，表明该模型拟合结果可接受。同时通过200次置换检测，Q2回归线与纵轴的相交点小于0，说明模型不存在过拟合，所建立的模型有效，该结果可用于黄芪产地对比分析，相关分析结果如图5和图6所示。结果表明，OPLS-DA将22批黄芪样本分为2类，所生成的变量VIP图如图7所示，并以VIP大于1为阈值，筛选出3个贡献值较大的成分，依次为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、铜和砷，判断其为区分甘肃、内蒙古样本的代表性差异成分。成分差异可能与药材的种植环境的不同相关。

图5 OPLS-DA得分图

图6 OPLS-DA模型置换验证图

图7 OPLS-DA模型VIP值

2.6 储藏对药材含量的影响

中药材成分往往根据性质的不同会随储藏时间、条件而变化，试验对采用聚乙烯袋密封储存于阴凉条件下的22批储存时间为4年的黄芪样本中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄芪甲苷含量进行测定（见表3），其中黄芪甲苷指标采用《中国药典》2015版和2020版2种检测方法（两者色谱条件相同，但供试品溶液处理方法不同）。结果表明，储存4年前后毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量根据产地批次的不同有较大的变化差异，含量均有所下降（10.3%～87.1%），平均下降约45.9%，其中共有5批次不符合《中国药典》要求；而黄芪甲苷指标含量变化较小，虽然部分批次药材存在含量差异，但两者均值非常相近；黄芪甲苷因《中国药典》不同版次检测方法的差异而含量结果有所差异，2015版含量测定结果相对较小，可能与供试品制备过程中采用萃取及树脂分离工序有关。以《中国药典》2015版黄芪指标成分测定结果对储藏前后的成分含量对比情况如图8所示，黄芪在长期储藏过程中需要关注毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量变化情况。

图8 黄芪储藏前后指标成分含量对比情况

表3 22批黄芪药材储藏4年后含量情况

3 结论

试验采集甘肃省定西市、陇南市及内蒙古自治区包头市共6个县/旗22批黄芪样品，并根据《中国药典》要求对黄芪各项指标进行测定，其中各样品均为原料直接采集，二氧化硫、有机氯类农药残留量均为符合《中国药典》要求，水分用于黄芪甲苷、毛蕊异黄酮含量计算，因此选择黄芪甲苷含量、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量、总灰分、浸出物和5个重金属共9个指标变量进行化学计算学分析。通过聚类分析，22个样本及9个变量指标均被分为4类，原料的分类与变量之间有一定相关性；而主成分分析共提取4个主成分，内蒙古包头市样本空间分布较为集中，甘肃省定西市、陇南市2个地域相近的样本也分布相近，两省/自治区的样本能实现较好区分，各样本得分的分布情况和特征向量与聚类分析结果相似，特征向量也与变量聚类分析结果相近；同时，通过OPLS-DA可实现对甘肃和内蒙古两省黄芪的有效区分，筛选出毛蕊异黄酮葡萄糖苷、铜和砷为甘肃、内蒙古样本的代表性差异成分；成分差异可能与药材的种植环境的不同相关。

黄芪甲苷与毛蕊异黄酮葡萄糖苷2个指标成分在黄芪储藏过程中的变化趋势存在差异，黄芪甲苷在储藏前后含量变化较小，而毛蕊异黄酮葡萄糖苷根据产地批次的不同变化差异较大（含量下降10.3%～87.1%），且有5个批次已不符合《中国药典》要求。因此，在黄芪原料工业生产过程中，需对储藏过程毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量变化情况加以关注。