酸枣仁中掺理枣仁的高效液相色谱法鉴别方法研究

张艳慧，付萍萍，汪安，张明童，王楠，李家港

作者单位：1保定市食品药品检验所，河北 保定 071000；2池州市质量监督检验研究院，安徽 池州 247100；3甘肃省药品检验研究院（甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室），甘肃 兰州 730070

酸枣仁收载于《中国药典》2020 年版一部，来源为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子［1］，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津的功效［2］。近年来酸枣仁药材资源紧缺，价格昂贵，质量参差不齐，掺伪现象频发。比较常见的有同科植物滇刺枣Ziziphus.mauritianaLam.的成熟种子，以滇枣仁、缅枣仁或理枣仁之名混充酸枣仁［3］。目前关于二者的掺伪研究很少，中国食品药品检定研究院刘薇等［4］在中药酸枣仁的真伪鉴别方法研究中报道过，酸枣仁与理枣仁在化学成分上有明显的差异，但未指出具体的化学成分。查阅相关文献［5-6］，成功提取出6'''-芥子酰斯皮诺素，采用高效液相色谱法（HPLC）测定其含量，该成分在酸枣仁与理枣仁药材中的含量存在很大的差异，该方法灵敏度高、准确度好且易于推广，可有效解决酸枣仁掺伪理枣仁的问题。本研究起止时间为2020年12月至2022年12月。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC-2010A 高效液相色谱仪（日本岛津公司），BP211D 型电子天平（精度为万分之一）［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，索式提取器（天津市北方玻璃仪器）。

1.2 试剂、试药6'''-芥子酰斯皮诺素对照品（第三方公司提纯，含量以94.8%计）；乙腈（默克化工技术（上海）有限公司，批号11166230132）为色谱纯，水（高碑店娃哈哈宏振食品饮料有限公司，批号3119GH）为超纯水，其他试剂均为分析纯；酸枣仁药材（10 批次），理枣仁药材（10 批次），经河北省药品医疗器械检验研究院段吉平主任药师鉴定，见表1。

表1 酸枣仁和理枣仁药材样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Agela Venusil ASB C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相：乙腈为流动相A，0.2%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱条件见表2。检测波长：335 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；对照品溶液进样量：10 μL，供试品溶液进样量：20 μL；理论塔板数均不低于2 000。

表2 梯度洗脱条件

2.2 溶液的制备对照品溶液的制备：取对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 毫升含0.231 6 mg 的溶液，作为对照品储备液。精密量取上述对照品储备液3 毫升至10 毫升量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛），精密称取2 g，置索氏提取器中，加石油醚（60～90 ℃）80 mL，回流4 h，弃去石油醚液，药渣挥去溶剂，转移至锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，回流2 h，放冷，再称定质量，加70%的乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液［7］。

2.3 方法学考察线性关系考察：取对照品储备液逐级稀释得6 个质量浓度水平的对照品稀释液，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到回归方程Y=187 507X+17 896，线性范围为2.32～138.96 μg/L，相关系数（r）=1，表明方法线性关系良好［8］。

精密度试验：精密吸取“2.2”项下同一对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次测定，结果峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.28%（n=6），表明仪器精密度良好［9］。

重复性试验：取同一批（批次为L9，S4）样品各6份，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果含量的RSD分别为1.51%、1.83%（n=6），表明方法重复性良好［10］。

定量限（LOQ）和检测限（LOD）：将“2.2”项下的对照品溶液逐级稀释，并依次进样测定。按信噪比（S/N）=10 计算，该方法测定6'''-芥子酰斯皮诺素的定量限为2.08 μg/L；按S/N=3计算，该方法测定6'''-芥子酰斯皮诺素的检测限为0.69 μg/L。

稳定性试验：将供试品溶液（批次为L9，S4）在0、1、2、4、8、16、24 h 分别进样测定，结果峰面积的RSD 为0.26%、0.33%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定［11］。

加样回收试验：分别精密称取已知含量的理枣仁和酸枣仁（批次L9、S4）（过四号筛）1 g，分成两组，每组6 份，分别精密加入定量的对照品储备液，按“2.1”项下色谱条件测定，并计算6'''-芥子酰斯皮诺素的加样回收率［12］。理枣仁回收试验结果见表3，酸枣仁回收实验结果见表4。

表3 理枣仁6'''-芥子酰斯皮诺素回收试验结果（n=6）

表4 酸枣仁6'''-芥子酰斯皮诺素回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定（1）取不同批次酸枣仁（S1～S10）及理枣仁（L1～L10）样品各2.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量，结果见表5。

表5 酸枣仁和理枣仁样品测定6'''-芥子酰斯皮诺素结果/%

（2）取不同批次酸枣仁（S1～S10）分别加入理枣仁（L9），理枣仁占总质量的3%，取上述10份样品各2.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量，结果见表6。

表6 酸枣仁3%掺伪样品（理枣仁）10份测定6'''-芥子酰斯皮诺素结果/%

3 讨论

3.1 提取方法的选择本方法是在《中国药典》2020 年版一部酸枣仁含量测定方法的基础上加以改善而成。该方法通过定量加入70%乙醇，定量吸取滤液，可有效避免供试品溶液的损失，且该方法更简单、重现性好、回收率高。

3.2 选取“酸枣仁3%掺伪样品”作为判定依据的理由《中国药典》2020 年版四部 0212 药材和饮片检定通则规定：除另有规定外，饮片中药屑及杂质通常不得过3%，故选取“酸枣仁3%掺伪样品”作为判定依据。

3.3 耐用性试验按照《中国药典》2020 年版四部9101 分析方法验证指导原则的要求，对方法的耐用性进行考察。首先，选用了3种品牌的色谱柱，分别为Agela Venusil ASB C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）、ShimNex CS C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），结果不同色谱柱测定的6'''-芥子酰斯皮诺素含量差异不大，RSD＜2.0%。其次，选取了3 个品牌的高效液相色谱仪，分别为岛津2010AHT、Agilent1260、Waters2695，结果不同仪器测得数据的RSD＜1.5%。同时检测不同柱温，不同流量，不同流动相比例，结果试验中测得的数据RSD＜2.0%［13］。

3.4 样品收集本次实验共收集到酸枣仁样品10批次［14］，产地覆盖东北、河北、山东、山西、陕西、甘肃等几大产区；理枣仁样品10次，经市场调研，目前理枣仁样品为越南进口品种，为了保证所用样品具有代表性，分批次从不同商户手中购买。

3.5 结果判定经实验检测其在酸枣仁中含量范围为0.003 3%～0.005 1%，在理枣仁中含量范围为0.050 6%～0.066 0%，3%掺伪样品中含量范围为0.005 0%～0.007 2%。由上述数据可判定，当样品含量高于0.007 2%时，即可判定酸枣仁样品中掺有理枣仁。

3.6 方法评价改进方法操作简单［15］，样品前处理方便，准确性好，回收率高，可靠性强，成功率高，对酸枣仁的质量控制［16］具有一定科学价值，经初步研究，此方法可适用于胶囊剂中酸枣仁药材的掺伪鉴别，为中成药中酸枣仁掺伪鉴别奠定科学依据［17］。