柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂制备及其体内药动学研究

李晓蒙，郑妩媚，张智强

（1.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064； 2.雄安创新研究院，河北 雄安 071800）

柚皮素属于二氢黄酮类化合物［1］，具有抗肿瘤、抗动脉硬化、抗炎、抗纤维化、镇咳、抗心律失常等药理活性［1-2］，可通过多靶点作用来对胃癌显示出良好的治疗作用［3］，还能通过多途径来促进乳腺癌细胞凋亡［2］，并且其毒性极低［4］，具备开发成新药的潜力。该成分在蒸馏水及不同pH 值磷酸盐缓冲液中的溶解度为34.13 ～79.52 μg/mL，属于生物药剂学分类中的Ⅳ药物［5］，但其体内吸收受外排作用的影响［6］，导致口服生物利用度仅为5.81%［7］。目前，已有柚皮素PLGA 纳米粒［8］、固体脂质纳米粒［9］、脂质体［10］等报道，但载药量均较低。

纳米混悬剂是在稳定剂作用下制备的一种“纯” 药物纳米制剂［11-12］，载药量高，可提高水溶性，促进药物溶出，但对其脂溶性改善程度有限［13］，而磷脂复合物可明显改善药物脂溶性［14-16］，故将其与纳米混悬剂联用可有效促进药物体内吸收。本实验制备柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂，并考察其体内药动学，以期为该成分提供一种新型纳米制剂。

1 材料

AL204 型电子天平［梅特勒托利多仪器（上海） 有限公司］； MS-H-S 型磁力搅拌器［大龙兴创实验仪器（北京） 股份公司］； Agilent 1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； Winner 802型激光粒度仪 （济南微纳颗粒仪器股份有限公司）； LM20 型高压微射流均质机 （ 美国Microfluidizer 公司）； MIRA3 型扫描电镜 （捷克Tescan 公司）； DHJ-25C 型实验型冻干机（上海博登生物科技有限公司）； JC-220B 型氮吹仪（聚创华业仪器有限公司）。

柚皮素对照品（批号20200712，纯度98.3%，成都德思特生物技术有限公司）； 染料木素对照品（批号K18642，纯度98.0%，西安开来生物工程有限公司）。柚皮素原料药（批号20200328，纯度97.0%，陕西秦邦药业有限公司）。维生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS，南京康满林化工实业有限公司）； 大豆磷脂（批号210826，磷脂酰胆碱含量为92%，爱必信上海生物科技有限公司）； 甘露醇（批号20191020，河北源创生物科技有限公司）。

健康SD 大鼠，雌雄兼具，体质量（220±20） g，购自河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法与结果

2.1 柚皮素含量测定 参考文献［8］ 报道，采用HPLC 法。

2.1.1 色谱条件 Angilent SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相甲醇-0.1% 醋酸（60 ∶40）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长288 nm。

2.1.2 线性关系考察 称取柚皮素对照品25 mg，置于100 mL 量瓶中，加入60 mL 甲醇，超声提取3 min 溶解，甲醇稀释至刻度，即得0.25 mg/mL对照品溶液，流动相依次稀释至10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标 （Y） 进行回归，得方程为Y＝22.015 5X＋0.024 7 （r＝0.999 8），在0.05 ～10 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 取磷脂复合物纳米混悬剂1 mL （柚皮素质量浓度约为250 μg/mL），置于50 mL 量瓶中，加甲醇超声提取3 min，流动相稀释至刻度，6 000 r/min 离心10 min，即得。

2.1.4 方法学考察 取10、1、0.05 μg/mL 对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得柚皮素峰面积RSD 分别为0.22%、0.46%、0.38%，表明仪器精密度良好。取“2.1.3” 项下供试品溶液适量，于0、3、6、9、18、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮素峰面积RSD 为1.44%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。按“2.1.3” 项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮素含量RSD 为1.60%，表明该方法重复性良好。取9份磷脂复合物纳米混悬剂，每份0.5 mL，分成低、中、高3 组，分别加入0.25 mg/mL 对照品溶液0.3、0.5、0.8 mL，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮素平均加样回收率分别为101.44%、100.08%、100.96%，RSD 分别为0.46%、0.81%、0.72%。

2.2 磷脂复合物及其纳米混悬剂制备

2.2.1 磷脂复合物 参考文献［14］ 报道，取柚皮素原料药适量，置于40 ℃真空干燥箱中1 d 以除尽水分，取0.5 g 加到100 mL 四氢呋喃中，加入1.5 g 大豆磷脂，45 ℃水浴800 r/min 搅拌3 h，得澄清透明溶液，在45 ℃下减压旋蒸除去四氢呋喃，即得。由于柚皮素不溶于二氯甲烷，而磷脂复合物易溶于后者，故加入该溶剂复溶，0.45 μm 微孔滤膜过滤除去未参加复合的原料药，参考文献［14］ 报道测得复合率为99.3%。

2.2.2 磷脂复合物纳米混悬剂 参考文献［15，17］ 报道，取磷脂复合物50 mg，置于10 mL 乙醇中溶解，作为有机相； 制备含一定浓度稳定剂的水相50 mL，室温下800 r/min 搅拌溶解，将有机相缓慢滴到水相中，在250 W 下超声提取5 min，在45 ℃下减压旋蒸20 min，立即在一定均质压力下循环均质数次，置于-10 ℃冰箱中固化10 min，取出，补加蒸馏水至50 mL，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.3 粒径、PDI、Zeta 电位测定 取磷脂复合物纳米混悬剂适量，蒸馏水稀释50 倍，取适量在粒度分析仪上进行测定，平行3 次，取平均值。

2.4 制备工艺优化 采用单因素试验。

2.4.1 稳定剂种类 固定磷脂复合物用量50 mg，稳定剂与磷脂复合物用量比例3 ∶1，均质压力100 MPa，均质次数8 次，考察稳定剂种类对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表1。由此可知，单用泊洛沙姆188、PVP K30 或TPGS 时磷脂复合物纳米混悬剂粒径较大，而联用PVP K30 ＋TPGS（1 ∶1） 时粒径、PDI 最小，Zeta 电位绝对值大于30 mV，故选择其作为稳定剂。

表1 稳定剂种类对粒径、PDI、Zeta 电位的影响（n＝3）Tab.1 Effects of stabilizer type on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.2 稳定剂与磷脂复合物用量比例 固定磷脂复合物用量50 mg，稳定剂PVP K30＋TPGS （1 ∶1），均质压力100 MPa，均质次数8 次，考察稳定剂与磷脂复合物用量比例对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表2。由此可知，稳定剂用量过小时粒径、PDI 较大，Zeta 电位绝对值较小； 随着稳定剂比例增加，粒径、PDI 均先降后升，Zeta 电位绝对值逐渐升高； 当两者比例为3 ∶1 时，粒径、PDI 较小，Zeta 电位绝对值较大，故选择其作为稳定剂与磷脂复合物用量比例。

表2 稳定剂与磷脂复合物用量比例对粒径、PDI、Zeta 电位的影响（n＝3）Tab.2 Effects of stabilizer-phospholipids complex consumption ratio on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.3 均质压力 固定磷脂复合物用量50 mg，稳定剂为PVP K30＋TPGS （1 ∶1），稳定剂与磷脂复合物用量比例3 ∶1，均质次数8 次，考察均质压力对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表3。由此可知，均质压力对Zeta 电位绝对值影响不大，为80 MPa 时粒径大于400 nm，PDI 大于0.3； 随着均质压力增加，粒径、PDI 先降后升，表明其过大时会导致粒径变大，分布不均匀，为100 MPa时两者较小，故选择其作为均质压力。

表3 均质压力对粒径、PDI、Zeta 电位的影响（n＝3）Tab.3 Effects of homogenization pressure on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.4.4 均质次数 固定磷脂复合物用量50 mg，稳定剂PVP K30＋TPGS （1 ∶1），稳定剂与磷脂复合物用量比例3 ∶1，均质压力100 MPa，考察均质次数对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表4。由此可知，均质次数较少时粒径、PDI 均较大，但过多时两者有减小趋势； 均质10 次时粒径、PDI较小，Zeta 电位绝对值大于30 mV，故选择其作为均质次数。

表4 均质次数对粒径、PDI、Zeta 电位的影响（n＝3）Tab.4 Effects of homogenization frequency on particle size，PDI and Zeta potential （n＝3）

2.5 验证试验及形态观察

2.5.1 验证试验 根据“2.4” 项下结果，得到最优处方为磷脂复合物用量50 mg，稳定剂PVP K30＋TPGS （1 ∶1），稳定剂与磷脂复合物用量比例3 ∶1，均质压力100 MPa，均质次数10 次。按上述优化处方平行制备3 批样品，测得平均粒径（图1）、PDI、Zeta 电位（图2） 分别为（260.53±25.86） nm、0.160±0.024、（-31.08±1.37） mV。

图1 柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂粒径分布Fig.1 Particle size distribution of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

图2 柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂Zeta 电位Fig.2 Zeta potential of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

2.5.2 形态观察 取磷脂复合物纳米混悬剂适量，蒸馏水稀释50 倍，涡旋2 s 混匀，滴到铜胶带上，置于30 ℃真空干燥箱中干燥30 min，喷溅1 min，在扫描电镜下放大50 000 倍进行观察，结果见图3。由此可知，该制剂基本形态为类球形或椭圆形，并且其粒径与激光粒度仪所测值存在一定差异，这是因为扫描电镜观察前需对样品进行干燥。

图3 柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopic image of nanosuspensions of naringenin phospholipids complex

2.6 冻干粉制备 取磷脂复合物纳米混悬剂适量，加入5%甘露醇，振荡溶解，分装至西林瓶中，置于-50 ℃超低温冰箱中预冻1 d，转移到-30 ℃冷冻干燥机中抽真空，冷冻干燥1 d，即得，蒸馏水复溶后，测得其平均粒径、PDI、Zeta 电位分别为（281.16±28.96） nm、0.184±0.027、（-28.17±1.05） mV。另外，磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉中柚皮素含量为（0.45±0.02）%。

2.7 冻干粉稳定性考察 取磷脂复合物纳米混悬剂及其冻干粉适量，密封后置于恒温恒湿箱（温度30 ℃，相对湿度65%） 中，发现磷脂复合物纳米混悬剂在第3 天即可肉眼观察到底部沉淀，而冻干粉于0、10、15、30、45、60、75、90 d 取样，蒸馏水复溶后测定粒径、PDI，结果见图4。由此可知，冻干粉放置90 d 后复溶时粒径仍小于300 nm，PDI 仍小于0.3，表明制成冻干粉后可增强磷脂复合物纳米混悬剂稳定性。

2.8 X 射线粉末衍射（XRPD） 分析 取柚皮素原料药、空白辅料（辅料比例同磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉）、物理混合物（柚皮素原料药＋空白辅料，比例同磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉）、柚皮素磷脂复合物、柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉适量，填充至样品槽中，压平整后进行分析，结果见图5。由此可知，原料药在7.2°、8.8°、12.2°等处晶型峰较强； 在物理混合物中上述晶型峰仍可观察到； 在磷脂复合物及其纳米混悬剂冻干粉中原料药上述晶型峰消失，表明该成分以无定型状态存在。

2.9 溶解度、油水分配系数测定

2.9.1 溶解度 按“2.5.1” 项下最优处方制备磷脂复合物纳米混悬剂，以柚皮素原料药与磷脂的物理混合物代替磷脂复合物来制备纳米混悬剂，按“2.6” 项下方法制成冻干粉。取柚皮素原料药、柚皮素磷脂复合物、柚皮素纳米混悬剂、柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉适量，置于20 mL 蒸馏水及pH 2.0、4.5、6.8、7.4 磷酸盐缓冲液中，在250 W 下超声处理15 min，在25 ℃下磁力搅拌2 d，混悬液过滤，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算溶解度，结果见图6。由此可知，磷脂复合物纳米混悬剂在蒸馏水、不同pH 值磷酸盐缓冲液中的溶解度高于其他3 种样品。

图6 各样品溶解度（n＝3）Fig.6 Solubilities of various samples （n＝3）

2.9.2 油水分配系数 取柚皮素原料药、柚皮素磷脂复合物、柚皮素纳米混悬剂、柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉适量，加到正辛醇饱和蒸馏水及pH 2.0、4.5、6.8、7.4 磷酸盐缓冲液中，在250 W 下超声提取15 min，在25 ℃下磁力搅拌2 d，取上层混悬液，过0.45 μm 水性滤膜，测定浓度C1； 取水相5 mL，加到饱和后同体积正辛醇中，在25 ℃下磁力搅拌2 d，5 000 r/min 离心，取下层水相，测定浓度C0，计算油水分配系数P，公式为P＝ （C1-C0） /C0，并计算lgP，结果见图7。由此可知，将原料药制成磷脂复合物后lgP升高，表明其脂溶性得到改善； 纳米混悬剂lgP降低，可能是由于它对原料药水溶性的提高程度大于对脂溶性的所致； 磷脂复合物纳米混悬剂lgP高于纳米混悬剂，可能与磷脂复合物可提高原料药脂溶性有关。

图7 各样品油水分配系数（n＝3）Fig.7 Oil-water partition coefficients for various samples （n＝3）

2.10 解离率测定

2.10.1 均质前磷脂复合物 取磷脂复合物50 mg（柚皮素含量为W0），置于10 mL 乙醇中溶解，作为有机相； 取蒸馏水50 mL，室温下磁力搅拌（800 r/min），作为水相，将有机相缓慢滴到水相中，在250 W 下超声提取5 min，在45 ℃下减压旋蒸20 min，蒸馏水定容至50 mL，12 500 r/min 离心30 min，弃去上清液，残渣中加入约20 mL 二氯甲烷振荡10 min，转移至25 mL 量瓶中，二氯甲烷定容至刻度，过0.45 μm 微孔滤膜，减压旋蒸除去有机溶剂，即得，甲醇复溶，测定柚皮素含量W1，计算磷脂复合物在水中的解离率，公式为解离率＝ （1-W1/W0） ×100%。

2.10.2 均质后磷脂复合物 取新制备的磷脂复合物纳米混悬剂0.1 mL，加入乙醇10 mL，超声提取10 s 溶解，减压旋蒸除去溶剂得残渣（不加热），测定柚皮素含量W0，按“2.10.1” 项下方法测定残渣中未解离磷脂复合物的量W1，计算解离率。

2.10.3 冻干后磷脂复合物 取新制备的磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉约50 mg，加入1 mL 蒸馏水复溶，精密量取0.1 mL，按“2.10.2” 项下方法测定W1，计算解离率。

2.10.4 结果分析 均质前磷脂复合物解离率为17.86%，均质后增加至28.61%，进一步制成冻干粉后为29.07%，表明冻干未对其解离率产生明显影响。

2.11 体外释药研究 取柚皮素原料药、柚皮素磷脂复合物、柚皮素纳米混悬剂冻干粉、柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉适量（柚皮素含量10 mg），加入6 mL 蒸馏水，转移至透析袋中（截留分子量8～12 kDa），扎紧，设置转速为75 r/min，介质为1 000 mL 蒸馏水，待介质恒温至37 ℃时放入样品，取样点选择0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、18、24、36 h，取样、补加蒸馏水体积均为4 mL，0.45 μm 水膜过滤，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算累积溶出度，结果见图8。由此可知，原料药36 h 内累积释放度为44.52%，磷脂复合物增加至63.34%，而磷脂复合物纳米混悬剂4 h 内累积释放度即达90%以上。

图8 各样品体外释药曲线（n＝3）Fig.8 In vitro drug release curves for various samples （n＝3）

2.12 体内药动学研究

2.12.1 灌胃液制备 取柚皮素原料药、柚皮素磷脂复合物、柚皮素纳米混悬剂冻干粉、柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂冻干粉适量，0.5% CMC-Na 溶液制成混悬液，即得（柚皮素含量5 mg/mL，临用现配）。

2.12.2 分组、给药与采血 24 只大鼠随机分为4组，每组6 只，分别给予 “2.12.1” 项下药液（30 mg/kg），于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h 置于盛有乙醚的容器中，麻醉5 s 后眼眶采血各约250 μL，置于肝素浸润离心管中，棉球覆盖于采血处止血，3 000 r/min 离心3 min，取上层血浆，低温保存。

2.12.3 血浆样品处理 参考文献［18］ 报道，取100 μL 血浆样品，加入NH4H2PO4缓冲液（0.06 mol/L，pH 5.0）、甲醇各100 μL，涡旋1 min，加入1 mL 乙酸乙酯，涡旋3 min 后6 500 r/min 离心5 min，吸取上层有机相至离心管中，40 ℃氮气吹干，加入100 μL 甲醇复溶。

2.12.4 线性关系考察 取柚皮素对照品适量，甲醇制成2 000、1 000、500、100、50 ng/mL 溶液，分别取100 μL，40 ℃氮气吹干，加入100 μL 空白血浆，涡旋1 min，即得质量浓度分别为2 000、1 000、500、100、50 ng/mL 的血浆对照品溶液，按“2.12.3” 项下方法处理，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品与内标（染料木素）峰面积比值（Y） 对对照品质量浓度（X） 进行回归，得方程为Y＝0.001 3X＋0.156 2 （r＝0.994 8），在50～2 000 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.12.5 方法学考察 取柚皮素原料药给药1.5 h后的血浆样品适量，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得对照品与内标峰面积比值RSD 为9.66%，表明样品在24 h内稳定性良好。取50、500、2 000 ng/mL 血浆对照品溶液适量，同一天内在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得对照品与内标峰面积比值RSD 分别为8.12%、5.04%、6.13%，表明该方法日内精密度良好； 同法连续测定6 d，每天1 次，测得两者比值 RSD 分别为 5.02%、9.42%、7.88%，表明该方法日间精密度良好。取50、500、2 000 ng/mL 血浆对照品溶液适量，按“2.11.3”项下方法处理，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得柚皮素平均加样回收率分别为94.05%、93.80%、95.17%，RSD 分别为8.14%、5.09%、4.18%。

2.12.6 结果分析 血药浓度-时间曲线见图9，再采用3P97 程序统计矩模型计算主要药动学参数，结果见表5。由此可知，与原料药比较，磷脂复合物tmax无显著差异（P＞0.05），但Cmax、AUC0～t升高（P＜0.05），相对生物利用度增加至1.97 倍；纳米混悬剂、磷脂复合物纳米混悬剂tmax缩短（P＜0.05），Cmax升高（P＜0.01），相对生物利用度分别增加至3.07、4.38 倍，而与纳米混悬剂比较，磷脂复合物纳米混悬剂Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05）。

图9 柚皮素血药浓度-时间曲线（n＝6）Fig.9 Plasma concentration-time curves for naringenin （n＝6）

表5 柚皮素主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetics parameters for naringenin （±s，n＝6）

表5 柚皮素主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.5 Main pharmacokinetics parameters for naringenin （±s，n＝6）

注： 与柚皮素原料药比较，*P＜0.05，**P＜0.01； 与柚皮素纳米混悬剂比较，＃P＜0.05。

参数单位柚皮素原料药柚皮素磷脂复合物柚皮素纳米混悬剂柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂tmaxh2.11±0.272.23±0.360.96±0.28*1.03±0.31*Cmaxng·mL-1426.33±63.10623.57±94.34*990.93±148.75**1 492.13±203.68**＃AUC0～tng·mL-1·h1 122.73±194.042 209.81±235.01*3 452.10±351.77**4 923.48±512.84**＃AUC0～∞ng·mL-1·h1 210.27±202.522 296.54±246.23*3 508.56±382.60**5 219.67±560.87**＃

3 讨论与结论

何小燕等［16］对柚皮素磷脂复合物制备工艺进行研究，发现柚皮素与磷脂比例约为1 ∶5，即后者用量过大，故本实验重新考察该处方。前期报道，柚皮素制成磷脂复合物后溶出度较低，可能与该剂型黏性大、分散性差、疏水性强等因素有关［12］。根据Ostwald-Freundlich 方程可知，药物粒径对溶解度、溶出速率、溶出度影响很大［19］，而磷脂复合物本身具有较强的疏水性，故需引入纳米混悬剂加以改善［20］。

一般认为，药物吸收最佳logP范围为-1 ～2［14］，柚皮素磷脂复合物在pH 2.0、4.5 下该数值均为2.5 左右，可能会影响吸收，而其纳米混悬剂在1～2 之间，有利于吸收。药动学研究结果表明，柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂tmax缩短，可能与该制剂前期释药速率较快有关；Cmax升高，一方面由于磷脂复合物纳米混悬剂提高了原料药水溶性和脂溶性，另一方面与药物累积溶出度明显改善有关；相对生物利用度增加至4.38 倍，可能与多种因素有关，例如无定形药物比晶型药物更易吸收［21］；纳米药物与胃肠道接触更充分，有利于吸收； 柚皮素水溶性、脂溶性、溶出度得到改善，解决了吸收瓶颈［19-22］； 处方中TPGS、磷脂等辅料具有促吸收作用［6］等。

综上所述，本实验为柚皮素磷脂复合物纳米混悬剂后续药效学研究奠定了基础，也为相关纳米制剂开发提供了新思路。