电离辐射生物标志物研究与应用进展

欧红玲＊，艾文超＊，王岩，马盈盈，时磊，张巧云，宋秀军，王欣茹

（1.火箭军特色医学中心检验科，北京 100088；2.火箭军广州特勤疗养中心体检科，广东广州 510515）

随着国家核能和核技术的开发利用，放射性装置已在工业、农业、国防、医学以及科学研究等各个领域得到广泛应用。然而，核材料中的放射性物质和矿石中释放的氡及其子体所产生的α、β、γ 和中子辐射，将不同程度地损害涉核作业人员的身心健康。目前，我国关于电离辐射损伤早期筛查主要局限于染色体畸变和微核的发现［1-2］，而细胞遗传物质的损伤往往是严重且不可逆的，不能反映早期电离辐射损伤的发生。随着分子生物学、细胞生物学、人类基因组学和蛋白质组学等基础学科的发展，电离辐射损伤相关指标的研究取得了一定进展。本文对近年来电离辐射损伤相关生物标志物的研究进行综述，以期对维护涉核作业人员身心健康和完善辐射防护等科学研究提供参考。

1 长期低剂量电离辐射生物标志物

1.1 外周血象

人体造血系统对电离辐射具有高度敏感性，高剂量辐射可增加血液系统疾病患病风险［3-4］。接触电离辐射放射医务人员红细胞压积、血红蛋白、血小板分布宽度和红细胞水平升高，而血小板、红细胞平均血红蛋白量、红细胞平均血红蛋白浓度、血小板平均体积、中性粒细胞及白细胞水平降低［5-7］。另一研究发现，放射医务人员凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间低于对照组，而淋巴细胞计数升高［8］。然而也有研究显示，长时间接触低剂量电离辐射人员白细胞、淋巴细胞和血红蛋白水平低于正常对照组，但红细胞和血小板差异无统计学意义［9］。也有研究表明，辐射长期累积剂量与血细胞数量无统计学相关性，外周血细胞的数量不能作为低剂量辐射的良好指标［10-12］，这可能与低剂量辐射对外周血影响存在辐射滞后效应相关［13］，或者与电离辐射剂量和人群相关。因此，外周血细胞计数是否能作为低剂量辐射潜在辐射效应的有效指标仍有待进一步研究论证。

1.2 淋巴细胞染色体畸变和微核率

根据国家职业卫生标准GBZ 235—2011《放射工作人员职业健康监护技术规范》的要求，外周血淋巴细胞染色体畸变（双着丝粒染色体+环状染色体分析）和外周血淋巴细胞微核检测是放射工作人员职业健康检查的必检项目［14］。研究显示，放射工作人员外周血染色体畸变细胞率、微核细胞率和微核率均高于对照组［2，9，15-16］，女性微核细胞率及微核率高于男性［17-19］，且长期接触低剂量电离辐射放射工作人员外周血淋巴细胞染色体畸变与微核率呈正相关［20-21］。辐射剂量较低模式下（＜100 mSv），辐射暴露组外周血淋巴细胞染色体损伤导致微核形成的频率高于未辐射对照组且与辐射剂量无关，外周血淋巴细胞微核率可以作为长期低剂量电离辐射的敏感指标［1］。放射工作人员外周血淋巴细胞核质桥率高于正常健康人群［22］。

1.3 甲状腺功能

三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素和促甲状腺激素是判断甲状腺功能最基本的筛选指标，然而目前甲状腺功能对于长期低剂量接触电离辐射人群是否具有较好的敏感性，不同研究调查的结论存在差异。多数文献报道辐照组三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素和促甲状腺激素水平均高于正常对照组［23-24］，但也有研究表明，三者水平与是否长期接触低剂量电离辐射无关［25］。研究结果相互不一致可能与遗传背景和辐射剂量等因素影响有关，甲状腺功能能否成为涉核作业人员健康检查指标还需进一步研究确认。

1.4 其他

Kovalchck 等［26］报道，低剂量多次X 线照射（0.05 Gy·d-1，10 d）可诱导小鼠肝组织中P16基因启动子区CPG 岛呈现DNA 高甲基化状态。Wang等［27］研究也表明，低剂量多次X 线照射可诱导Rad23b和Ddit3启动子区CPG 岛呈现DNA 高甲基化状态。李曼蓉［28］对人正常细胞的体外研究发现，低剂量X 线辐射易诱导全基因组及MGMT启动子DNA甲基化状态的改变，且慢性照射组较急性照射组更易诱导全基因组DNA 甲基化水平降低和MGMT启动子甲基化。此外，Taki 等［29］和Uehara等［30］对慢性低剂量γ 射线暴露后雄性C57BL/6 小鼠肝、肾和睾丸组织中mRNA水平变化的研究发现，在0.05，1.00和20 mGy·d-1辐射剂量照射400 d后，分别导致肝组织出现了3，11 和20 个基因mRNA水平的改变，且大多数改变的基因在3 个剂量组中重叠，表明不同剂量辐射之间存在相似之处。蛋白质水平研究发现，肝组织中硫氰酸酶含量在1 和20 mGy·d-1暴露后升高，但在0.05 mGy·d-1剂量暴露下未升高［31］。Nakajima 等［32］发现，小鼠在慢性辐射暴露3 个月后肝组织胱天蛋白酶12、凋亡蛋白酶激活因子1和磷酸化β连环蛋白（pSer45）蛋白表达发生改变，但在辐射暴露方案完成后立即检测时未发生此变化，表明慢性低剂量辐射暴露可能对细胞凋亡过程有长期的影响。此外，Zhao 等［33］报道，在高脂饮食和低剂量辐射共同暴露下的小鼠，其肠道微生物群中副萨特菌属（Parasutterella）显著增加，同时肠道和血浆中吡咯烷羧酸水平也升高。Keiji 等［34］对慢性低剂量照射的跨代效应的研究发现，与未受辐射对照组相比，C57BL/6J雄性小鼠在连续400 d暴露于20 mGy·d-1γ 射线后，其后代小鼠出现新生拷贝数变异的数量显著增加。此外，Nur 等［35］评估了基于微RNA（microRNA，miRNA）表达水平对不同剂量γ 辐射暴露进行分类的可行性，miR-140-3p/133a-5p/145a-5p 在预测不同剂量γ辐射暴露的miRNA标记集中最常见，而miR-188-3p/26a-5p/26b-5p则是低剂量γ辐射所特异性的。

2 急性电离辐射生物标志物

2.1 核酸类标志物

以外周血细胞为基础的辐射损伤相关检测方法（如染色体畸变和微核率检测）耗时耗力。基于“DNA-RNA-蛋白质”方向合成的中心法则，核酸类标志物水平的变化通常早于蛋白质类标志物，具有成为早期评估辐射剂量反应的生物标志物的应用潜力。

2.1.1 mRNA

探讨性别和年龄因素对电离辐射诱导的离体人外周血中辐射敏感基因mRNA 表达变化的一项研究发现，与阴性对照组相比，各剂量γ射线照射组人外周血多个辐射敏感基因的mRNA 表达水平均明显增加，并且呈剂量-效应关系［36-37］，因此通过检测不同基因组合有望成为量化辐射损伤的标志物。不同剂量γ 射线照射48 h 后，T 细胞和B 细胞介导的基因表达受到显著影响，而且包括NKG7，GNLY和GZMA在内的NK 细胞毒性相关基因表达下调［38］。另一研究分析了辐射小鼠基因表达的趋势，在2～5 Gy 照射后数天内，基因差异表达的数量有所增加，并且基因差异表达的数量随辐射剂量的增加而增加，而SLC25A51和CCNA2的表达最初出现抑制，随辐射时间延长其转录水平有所恢复［39］。另一项针对小鼠和人外周血辐射相关基因差异表达的研究发现，CDKN1A，MDM2，BBC3和CCNG1基因在小鼠和人外周血细胞中均上调，而TCF4和MYC基因均下调。该研究还发现，DDB2，PCNA，GADD45A，SESN1，RRM2B，KCNN4，IFI30和PTPRO基因在小鼠中下调，但在人外周血细胞中上调［40］。在非人灵长类动物模型实验中发现，发生血液急性辐射综合征的狒狒在接受2.5 或5.0 Gy 的γ 射线辐射后，外周血WNT3，POU2AF1和ZZZ3基因的表达随时间持续变化［41］。最近的一项研究表明，白细胞介素3、ephrin 受体和表皮生长因子受体及心血管系统中的一氧化氮和Wnt/β连环蛋白信号途径及炎性小体途径与急性暴露于6.5 Gy γ 射线辐射后非人灵长类动物的生存预后相关［42］。

2.1.2 miRNA

miRNA 广泛存在于真核生物中，在细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中起重要作用。人类体液中miRNA 物理性状稳定，具有作为检测指标的潜力。研究发现，miR-23c 和miR-1287-5 表达水平在γ 射线照射后均显著升高，而miR-219a-2-3p 和miR-6511b-3p 等则显著降低［43］。另一研究发现，γ 射线照射后差异表达的miR-23c，miR-1287-5p，miR-219a-3p 和miR-320d 可能通过参与调控丝裂原活化蛋白激酶、RAS、P53、视黄酸诱导基因蛋白-Ⅰ等信号通路影响细胞增殖、凋亡、DNA 损伤修复及免疫调控，有望成为辐射损伤新的血液标志物［44］。此外，外周血miR-150［45］和白细胞miR-575［46］差异表达与辐射损伤有关，miR-181b-2-3p 与SRY 相关高迁移率族盒蛋白21（SRY-related high-mobility group box transcription factor 21，SOX21）的直接相互作用可能参与辐射诱导的小胶质细胞激活和增殖［47］。基于淋巴细胞来源的循环miR-150-5p 和肺高表达的循环miR-23a-3p 在0.5～3.5 Gy 较低辐射剂量范围内存在较好的剂量依赖效应，提示该指标在辐射灾害管理和临床应用中的潜在效用［48］。另一研究则发现，γ射线照射48 h后人外周血白细胞miR-150-5p和miR-342-3p对电离辐射敏感且具有剂量依赖效应，对急性辐射损伤快速评估具有一定潜力［49］。此外，Zhang 等［50］报道，血清外泌体中miR-151-3p和miR-128-3p可作为电离辐射暴露的剂量特异性生物标志物。

2.1.3 DNA甲基化

动物模型研究表明，电离辐射可诱导不同组织和细胞呈现DNA低甲基化，这种低甲基化与辐射剂量、性别和组织特异性相关，并且可持续存在［51］。田雪蕾等［52］利用甲基化芯片检测技术研究电离辐射对人外周血淋巴细胞DNA甲基化水平的影响，发现不同剂量γ 射线照射后，人外周血淋巴细胞甲基化水平显著上调的基因有1311 个，显著下调的有286 个，这些发生甲基化变化的基因涉及DNA 修复和维持染色体结构稳定等功能。另一研究显示，RAD54L-1&3，SMC1B-7，INIP-8，HIST1H4K-11和HIST1H4K-11&13DNA 修复和维持基因组稳定性相关基因启动子区甲基化水平与辐射密切相关［53］，提示DNA 甲基化作为潜在的辐射损伤标志物的可行性。

2.2 蛋白质类标志物

蛋白质组学分析也可以用来衡量辐射暴露的有害影响，辐射可能会改变调控网络或引起蛋白质组学修饰，如脱羧化、二硫键或聚集［54］，进而影响特定蛋白质的稳态水平。对单剂量γ 射线（0.02～1.00 Gy）全身照射小鼠肝蛋白质组的研究显示，辐射后小鼠的糖酵解水平和丙酮酸脱氢酶活性显著降低［55］。已有研究报道，非人灵长类动物暴露于6.7 和7.4 Gy 后，不同体液中辐射诱导的蛋白质组发生变化［56-57］，如铁蛋白、血管紧张素原前体蛋白、血管紧张素转换酶亚型1和其他未知蛋白等表达随辐射剂量和时间而变化。此外，Byrum 等［57］发现，尿液蛋白质组图谱确定了许多与细胞黏附、疾病进展和关键代谢途径相关的蛋白质。基于蛋白质组学的研究也表明，辐射后肿瘤衍生因子上调，在辐射治疗期间其可能作为潜在的治疗靶点［58］。辐射暴露导致的蛋白质组学变化与人类的生物学表型如炎症、毒性、免疫反应和维甲酸信号传导相关［59-60］。此外，几项研究分析了不同组织，以测量辐射暴露导致的蛋白质丰度的变化。Liu 等［61］研究报道，转录因子核因子e2 相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）依赖的抗氧化反应在辐射后被激活，作为骨髓中Nrf2 依赖的下游靶酶如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶1 和血红素加氧酶1 在辐射暴露后含量升高，而谷胱甘肽S-转移酶Mu1 含量则持续下降。另一项研究则发现，脑组织超氧化物歧化酶活性随着辐射剂量的增加而递减，而丙二醛含量随辐射剂量的增加逐渐递增［62］。此外，闫华等［63］发现，ADP 核糖基化因子样6 相互作用蛋白低表达可促进照射后细胞DNA 损伤，抑制细胞存活，从而加重电离辐射所致小鼠小肠上皮细胞损伤。总之，上述研究展现了蛋白质作为高剂量暴露的可靠生物标志物的潜力，并可能为未来开发用于放射损伤诊断中血液检测的器官特异性蛋白生物标志物提供基础。

DNA 作为生物遗传信息的携带者，其损伤和修复是辐射生物学效应关注的重点。γ-H2AX 对受照人员DNA 双链断裂损伤修复具有重要作用。利用γ-H2AX 焦点计数可以估算照射剂量，而且其检测周期短，特异性和灵敏度相对较高，近几年被广泛应用于辐射剂量生物估算研究［64-65］。此外，重组人衍生生长因子相关蛋白3（hepatoma-derived growth factor related protein 3，HDGFRP3）和P53结合蛋白1 的复合体参与DNA 损伤修复的响应；HDGFRP3缺失会损害经典的非同源末端连接修复、增强DNA 末端切除［66］。参与染色质组织的CCCTC 结合因子是对辐射引起的DNA 损伤的早期反应者［67-68］。检测DNA损伤修复相关蛋白，可能用于反映辐射损伤严重程度。此外，一项通过分析指尖血的研究显示，唾液α-淀粉酶、Flt3配体和单核细胞趋化蛋白1在接受分次剂量全身照射治疗的肿瘤患者中升高。这些蛋白在单次急性或分次剂量的电离辐射后，在非人灵长类动物模型中表现出类似的辐射反应［69］，有望成为电离辐射的有效标志物。另一项研究显示，辐射超过100 mGy后淋巴细胞转化生长因子β 和干扰素γ 基因和蛋白表达水平显著升高［70］。

2.3 脂质与代谢相关标志物

采用靶向脂质组学的方法同时分析受到γ射线全身照射大鼠的血浆、小肠组织、脾和睾丸中脂质代谢物，发现多个具有良好剂量-效应关系和时间响应范围的辐射敏感脂质代谢物，对辐射早期分类、预测辐射诱导的组织损伤具有一定应用潜力［71］。γ射线照射后小鼠血清的全局脂质谱观察到低丰度的含氧多不饱和脂肪酸，辐射引起血清中磷脂酰胆碱和花生四烯酸水平显著增加，而携带含氧多不饱和脂肪酸的二酰基磷脂酰胆碱水平则下降［72］。非人灵长类动物的辐射暴露导致脂质代谢显著变化，包括游离脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂和酯化甾醇等所有主要脂质。暴露于10 Gy的非人灵长类动物的血清中含氧多不饱和脂肪酸的脂质和多不饱和甘油三酯水平显著升高［73］。也有研究发现，非人灵长类动物中血清脂质含量随辐射时间而发生变化。在6.5 Gy辐射作用下，24 h内出现明显的脂质组学变化，同时细胞因子、游离脂肪酸、单酰基甘油酯和C反应蛋白水平升高，而二酰基和三酰基甘油酯、鞘磷脂、溶血磷脂酰胆碱和酯化甾醇则同时减少［74］。鞘磷脂水平降低和溶血磷脂酰胆碱水平升高可能是急性照射后生物剂量测定的重要标志物。采用超高效液相色谱-质谱对18 Gy·min-1剂量照射后的肠道组织标本进行全局脂质组学分析，发现明显的脂质代谢物指纹图谱改变。与正常对照组相比，急性或慢性放射性肠炎组发生过氧化反应显著改变了几种脂质，如糖基神经酰胺、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷酸甘油、溶血磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱-磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇和鞘氨醇水平［75］。

辐射代谢组学标志物主要集中于对受辐射动物样本的质谱分析，监测发生改变的生物反应。代谢组学研究有助于了解小鼠、非人灵长类动物和人类的正常和受辐射器官中代谢物水平的变化。Gao等［76］检测了内酰胺、1，2，4-苯三醇、牛磺酸和胡椒碱等31种低相对分子质量代谢物，用于评估暴露于单次10 或20 Gy 剂量辐射时大鼠肺组织代谢的变化。此外，有研究报道，当小鼠暴露于3 和8 Gy（2.57 Gy·min-1）24 h 时，小鼠胃肠道代谢物或尿代谢物β-胸腺嘧啶和己烷基甘氨酸水平变化存在时间和剂量依赖性［77-78］。在6 Gy 辐射后12 h 内（0.92 Gy·min-1），也观察到骨髓、回肠、肝、肌肉和肺等组织的代谢谱发生了变化，这与DNA 甲基化、能量代谢和氨基酸代谢有关［79］。Pannkuk 等［80］报道，当暴露于2，4，6，7和10 Gy辐射剂量7 d时，雄性非人灵长类动物中发现13 个剂量反应性代谢生物标志物，包括黄嘌呤、L-肉碱和L-乙酰肉碱均增加。一项后续研究同样表明，在γ 射线照射下的非人灵长类动物中，肉碱和酰基肉碱的几种衍生物也发生了显著改变［81］。此外，在不同时间点采集血样分离外泌体，进行非靶向代谢组学和脂质组学分析的结果显示，非人灵长类动物经5.8 或6.5 Gy γ 射线全身照射后出现血脂异常、炎症和氧化应激的标志物，提示基于血浆和外泌体之间代谢物组成的差异，外泌体组学图谱分析可能增加对低丰度生物标志物的识别［82］。此外，在多种组织类型的辐照非人灵长类动物中，长链酰基肉碱显著升高，提示这类代谢物作为辐射诱导组织损伤的通用指标的可能性［83］。

3 结语

早期筛查、早期发现、早期阻断是保障广大涉核作业人员身心健康的关键。在核事故或放射性事故中，由于辐射的延迟症状和不同的反应，迫切需要开发强有力的生物标志物来评估个体损伤的程度，以便于伤员分类和治疗决策的快速制定。这将有助于提供有效地即时临床治疗，同时更好地利用有限的临床资源。长期暴露于低剂量电离辐射可使人体产生多种生物学效应，外周血相关标志物作为简单、快捷、有效的评估放射医务人员辐射生物效应的指标具有较好的应用潜力，但这仍需后续研究的进一步论证。近年来，一些与辐射剂量相关的生物代谢物、脂质、蛋白质和核酸展现出成为有效标志物的潜力，然而它们在宽剂量范围内的敏感性和稳定性均有待进一步提高。因此，分析涉核作业人员外周血相关检查、辐射相关基因表达及代谢产物等变化与辐射剂量反应的关系，确定辐射生物学效应及电离辐射剂量截断值，明确不同剂量电离辐射对人体健康状况的影响，对改善涉核作业人员工作环境、加强个人防护、完善辐射防护基础标准等均具有重要意义。