基于ERK5信号通路探讨薯蓣健脾益智合剂对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡的影响

刘煜　李鸣　吴永贵　杨琼

摘要 目的：探討薯蓣健脾益智合剂对血管性痴呆（VaD）大鼠海马神经元凋亡的影响以及相关作用机制。方法：采用改良双侧颈总动脉结扎（2－VO）法建立VaD大鼠模型，将120只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和治疗组，每组30只。治疗组予以10 mL/（kg·d）薯蓣健脾益智合剂灌胃，正常组、假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃，持续8周。观察大鼠一般状态，并于造模后第7天及造模后治疗4、8周分别进行行为学检测，苏木精－伊红（HE）染色观察海马神经元组织学改变，脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）染色观察海马神经元凋亡情况，免疫组织化学法检测丝分裂原活化蛋白激酶K2（MEKK2）、丝分裂原活化蛋白激酶K3（MEKK3）和丝裂原激活蛋白激酶5（MEK5）、细胞外信号调节激酶5（ERK5）表达的变化，蛋白免疫印迹法检测MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的蛋白表达。结果：与正常组及假手术组比较，模型组行为学表现差异显著，变性神经元增加，神经元凋亡率增加（P＜0.01），MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的表达减少；与模型组比较，治疗组行为学表现改善，变性神经元减少，神经元凋亡率降低（P＜0.05或P＜0.01），MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5表达增加。结论：薯蓣健脾益智合剂可能通过上调ERK5信号通路，抑制海马神经元凋亡，促进海马神经元的修复进而治疗VaD。

关键词 血管性痴呆；薯蓣健脾益智合剂；神经元凋亡；丝裂原激活蛋白激酶5，ERK5；实验研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.012

Effect of Modified Shuyu Pill on Hippocampal Neuron Apoptosis in Vascular Dementia Rats Based on ERK5 Signaling Pathway

LIU Yu， LI Ming， WU Yonggui， YANG Qiong

Hubei Province Hospital of TCM， Wuhan 430061， Hubei， China

Corresponding Author LI Ming， E－mail： 385579@qq.com

Abstract Objective：To investigate the effect of modified Shuyu Pill on hippocampal neuron apoptosis in rats with vascular dementia（VaD）.Methods：The modified bilateral common carotid artery ligation（2－VO） was used to establish the VaD rat model.One hundred and twenty rats were randomly divided into normal group，control group，model group，and treatment group，with 30 rats in each group.The treatment group was given 10 mL/（kg·d） modified Shuyu Pill by intragastric administration.The normal group，control group，and model group were given the same volume of normal saline.The intervention lasted for 8 weeks.Behavior detection were performed at the 7th day after modeling，and 4 and 8 weeks，vespectively after treatment.Histological changes of hippocampal neurons were observed by hematoxylin－eosin（HE） staining.The apoptosis of hippocampal neurons was observed by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）－mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.The expression of mitogen－activated protein kinase K2（MEKK2），mitogen－activated protein kinase K3（MEKK3），mitogen－activated protein kinase 5（MEK5），and extracellular signal－regulated kinase 5（ERK5） were detected by immunohistochemistry.The protein expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 were detected by Western Blot.Results：Compared with the normal group and control group，the behavior of the model group was significantly different，the degeneration of neurons increased，the apoptosis rate of neurons increased（P＜0.01），and the expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 decreased.Compared with the model group，the behavioral performance of the treatment group improved，the degeneration of neurons reduced，the apoptosis rate of neurons decreased（P＜0.05 or P＜0.01），and the expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 significantly increased.Conclusion：Modified Shuyu Pill may inhibit the apoptosis of hippocampal neurons and promote the repair of hippocampal neurons to treat VaD by up－regulating ERK5 signaling pathway.

Keywords vascular dementia; modified Shuyu Pill; neuron apoptosis; extracellular signal－regulated kinase 5， ERK5; experimental study

随着人口老龄化问题加剧，痴呆症的患病率预计将在未来几十年内不断增加［1］。血管性痴呆（vascular dementia，VaD）占痴呆病例的15%，是仅次于阿尔茨海默病（AD）的常见痴呆症，主要因脑缺血损伤，而表现出认知障碍与行为损害的进行性下降［2］。有研究发现，15%～30%的病人在脑卒中发生几个月后发展为痴呆，并且有20%～25%的病人发展为迟发性痴呆［3］。正是由于大脑的复杂协调，同时存在其他脑损伤原因，VaD病人认知功能的改变包含注意力、信息处理和执行功能的损伤等可能具有可逆性［4］。但针对VaD的治疗缺乏特异性，很少有药物被批准专门用于预防或治疗VaD。因此，与AD相似，VaD的治疗策略包括使用胆碱酯酶抑制剂和美金刚等，以及心理支持治疗。中医药不仅能缓解VaD病人的临床症状，还可以预防VaD的发生。在前期研究中已发现，薯蓣健脾益智合剂能明显改善VaD病人临床评分量表［5］，减少神经元凋亡，修复海马神经元，改善记忆功能减退［6］，但其具体机制仍不清楚。因此，本研究采用改良双侧颈总动脉结扎（2－VO）法［7］建立VaD大鼠模型，观察大鼠行为学、海马病理改变以及相关信号传导的变化，进而分析薯蓣健脾益智合剂改善VaD海马神经元凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康无特定病原体（SPF）级Wistar大鼠120只，购自湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK（鄂）2015－0018，雄性，体质量（250±20）g。于SPF级动物房饲养，自由进食水，适应性饲养1周。严格遵守实验室动物保护指导原则进行动物研究，实验设计以及实验流程均经过动物伦理委员会批准。

1.2 实验药物

薯蓣健脾益智合剂，由湖北省中医院药剂科制备（批准文号：鄂药制字Z20150027，批号：20160913），组方：山药30 g，熟地黄24 g，制何首乌24 g，党参20 g，白芍20 g，当归20 g，远志12 g，石菖蒲14 g，川芎10 g，炒白术18 g，茯苓18 g，杜仲12 g，枸杞子18 g，五味子10 g。将方药浸泡0.5 h后水煎3次，过滤合并，经物理方法将合并后的水煎剂浓缩至每毫升含原生药量1.0 g，经120 ℃、400 kPa条件下消毒25 min，冷却后4 ℃保存备用。

1.3 试剂与仪器

磷酸缓冲盐溶液（PBS）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、甲醇均购自武汉谷歌生物有限公司（货号分别为R20259、R21295、S30288）；兔多抗丝分裂原活化蛋白激酶K2（MEKK2）、鼠单抗丝分裂原活化蛋白激酶K3（MEKK3）、兔多抗丝裂原激活蛋白激酶5（MEK5）、鼠单抗细胞外信号调节激酶5（ERK5）均购自美国Santa Cruz公司（货号分别为19607S、60291－1－Ig、18464S、19677－1－AP）；辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗大鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司（货号分别为BA1058、BA1054）等。

MT－200Morris水迷宫视频跟踪分析系统（成都泰盟科技有限公司）；台式高速冷冻离心机Neofuge 15R（Thermo公司）；全自动石蜡切片机（德国美康公司，型号：HM355 S型）；Bio－plex电泳仪（Bio－Rad公司）；荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（上海宏石医疗科技有限公司）；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）等。

1.4 模型制备

采用改良2－VO法制备VaD大鼠模型，乙醚吸入麻醉后，于手术台上固定，在颈部正中偏左切开皮肤，逐层钝性分离出左侧颈总动脉，依次结扎颈总动脉的近心端和远心端，用剪刀从中间剪断后进行缝合。1周后对右侧颈总动脉实施手术，方法同上。整个手术过程中进行电加热，以维持大鼠体温，保证生存。造模7 d后，用水迷宫检测大鼠探索平台的时间和通过平台的次数，与未造模大鼠相比，探索时间明显延长，通过次数显著减少，显示造模成功。

1.5 动物分组及给药方法

将120只大鼠采用随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组和治疗组，每组30只。正常组不予造模，正常饲养；假手术组作为对照，于颈部切开皮肤，分离出颈总动脉，既不结扎也不剪断，暴露5 min后直接缝合皮肤；模型组和治疗组均采用改良2－VO法进行模型制备。造模后第7天开始，根据前期给药剂量相关研究［8］，薯蓣健脾益智合剂成人（体重60 kg）推荐剂量为1.6 g/kg，按成人临床推荐剂量与人鼠换算公式，予以等剂量折算，即大鼠给药剂量＝人给药剂量×换算系数＝1.6 g/（kg·d）×6.3≈10 g/（kg·d），可得治疗组予以薯蓣健脾益智合剂煎剂10 g/（kg·d）灌胃，按照大鼠体质量及薯蓣健脾益智合剂水煎剂浓缩浓度，治疗组给予薯蓣健脾益智合剂10 mL/（kg·d）灌胃，正常组、模型组和假手术组给予生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃，持续8周。

1.6 检测指标及方法

各组大鼠行断颈处死，取大鼠海马组织，一部分放入4%多聚甲醛溶液中，常温或者4 ℃保存，另一部分放入1.5 mL灭菌的EP管中，并快速置入－80 ℃超低温冰箱，以备待测。

1.6.1 一般情况与行为学检测

从实验开始每天观察大鼠的形态、皮毛色泽、排泄物、精神情绪变化、活动程度以及饮食进水状况水平。

Morris水迷宫测试包含空间探索实验和定位航行实验，定位航行实验检测大鼠空间学习能力（逃避潜伏期）。將池分为4个象限，放置圆形平台在水池第3象限，每次根据第1象限、第2象限、第3象限、第4象限的顺序将大鼠放入池中，记录大鼠寻找到平台的时间，持续5 d。空间探索实验，是在第6天撤离平台，大鼠从第2象限放入，观察90 s内大鼠穿越平台次数和在第3象限停留时间。实验利用逃避潜伏期、通过平台的次数、目标象限停留百分比评价大鼠学习和记忆的能力。各组大鼠造模后1周（治疗前）、药物干预后第4周和第8周进行Morris水迷宫检测。

1.6.2 苏木精－伊红（HE）染色法评估海马形态变化

各组大鼠断颈处死后迅速取海马组织，中性固定液固定，石蜡包埋，切片（0.4 μm），二甲苯、乙醇梯度脱蜡并用苏木精、伊红染液染色，最后依次进行脱水、透明、封片，然后经37 ℃烤箱烘干置于切片盒中，常温保存，并使用显微镜和成像系统获取图像。

1.6.3 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法评估海马神经元凋亡水平

DNA核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）生物素末端标记法切口。按Bowringmann公司（德国）凋亡原位检测试剂盒程序。二甲苯脱蜡石蜡切片，37 ℃，20 mg/L蛋白酶K消化30 min，PBS洗涤3次，TUNEL反应液滴加，37 ℃，60 min，PBS震洗后洗涤加入转烷基苯酚（AP），37 ℃，60 min，最后加入显色底物滴加5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸盐（BCIP）/硝基四氮唑蓝（NBT），10 min终止反应，脱水，透明，封片，分析。结合CMIAS系列病理图像分析系统（4.0）凋亡分析模块，量化海马凋亡细胞数。

1.6.4 免疫组织化学法检测大鼠海马MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5表达水平

取大鼠海马组织进行脱水、石蜡包埋、切片，然后脱蜡和水化、抗原修复、消除内源性过氧化物酶活性、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、脱水、透明和封片。每组取10张切片，随机选择5个不同视野，运用Image－Pro Plus 6.0软件对MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5的表达进行累计光密度分析，计算平均光密度值。

1.6.5 蛋白免疫印迹法检测大鼠海马MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5蛋白表达水平

取大鼠海马组织，提取蛋白，将制备的蛋白样品通过制胶、上样、电泳、转膜、染色、一抗孵育、二抗孵育，显色后，应用全自动荧光与可见光凝胶成像分析系统曝光。以β－actin作为内参，运用分析软件对蛋白灰度值进行检测，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值作为该目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。首先对定量资料进行正态性、方差齐性检验，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One－Way ANOVA），组间两两比较采用LSD－t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态

造模前，各组大鼠一般情况正常，精神状态良好，反应灵敏，皮肤黏膜光滑红润，皮毛发亮有光泽，鼻头眼角无分泌物，耳廓色泽淡粉，粪便成形，干稀适中。正常组大鼠在整个实验过程中一般情况均无明显变化。假手术组于术后3 d内出现轻度的毛发脏乱和枯黄不顺、精神萎靡，其余一般情况良好。经正常饲养后，一般情况逐渐基本恢复，与正常组比较差异不明显。模型组大鼠于造模后，开始出现不同程度的毛发脏乱和枯黄不顺、懒动时常倦卧、厌食厌水、眼裂减小、唇甲紫暗、腹部胀满、四肢逐渐消瘦甚至逐渐死亡。予以药物灌胃后，与模型组比较，治疗组一般情况有明显改善。

2.2 Morris水迷宫实验结果

2.2.1 各组不同时间逃避潜伏期比较

造模后第7天（治疗前），模型组和治疗组逃避潜伏期较正常组、假手术组明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）；造模后治疗4、8周，治疗组逃避潜伏期较模型组明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

2.2.2 各组不同时间跨越平台次数比较

治疗前，模型组和治疗组跨越平台次数较正常组、假手术组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；治疗组在造模后治疗4、8周跨越平台次数较治疗前明显增加（P＜0.05）；造模后治疗8周，治疗组跨越平台次数较模型组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

2.3 海马神经元病理学结果

海马HE染色后显示，与正常组相比，模型组大鼠锥体细胞排列稀疏不规则，细胞间距变宽，细胞核体积变小，染色加深，核仁欠清，部分细胞坏死。与模型组比较，治疗组大鼠海马锥体排列整齐，细胞稍紧密，形态轮廓清晰，核仁清晰。详见图1。

2.4 TUNEL染色检测海马神经元凋亡结果

治疗前，模型组、治疗组大鼠海马神经元凋亡率较正常组、假手术组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；在造模后治疗4、8周，治疗组大鼠海马神经元凋亡率较模型组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。详见图2、图3、表3。

2.5 海马组织中MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的表达

2.5.1 免疫组织化学实验结果

在造模后治疗4周，治疗组海马神经元中MEKK2、MEK5阳性细胞光密度值较模型组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。在造模后治疗8周，模型组海马神经元中MEKK3阳性细胞光密度值较假手术组明显降低，治疗组海马神经元中MEK5阳性细胞光密度值较模型组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见图4、表4、表5。

2.5.2 蛋白免疫印迹实验结果

在造模后治疗4周，模型组海马神经元中MEK5蛋白表达较正常组、假手术组明显减少，治疗组MEK5蛋白表达则较模型组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。在造模后治疗8周，与假手术组比较，模型组海马神经元中MEKK3蛋白表达较假手术组明显减少，治疗组MEKK3蛋白则较模型组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。詳见图5、表6、表7。

3 讨 论

VaD是以认知和行为缺陷，并伴有相关神经血管损伤体征为特征的神经退行性病症［9－10］，其发病机制复杂，发病率逐年增长，严重威胁着老年人的身心健康，给社会和家庭带来沉重的负担。据报道，这些认知损伤主要由慢性脑灌注不足继发神经退行性变、神经细胞凋亡和神经炎症［11－12］。因此，本研究以神经细胞凋亡为切入点进行相关信号传导研究。

研究证明，薯蓣健脾益智合剂能有效抑制海马神经元凋亡，从而缓解VaD认知功能障碍［6］。本研究发现，经改良2－VO法造模后的大鼠存在明显的认知障碍，包括较长的逃避潜伏期和较短的目标象限时间，以及不同程度的毛色脏乱枯暗、唇甲紫暗、精神萎靡、睡眠增多等一般状态，证实2－VO法制作VaD模型的可行性。薯蓣健脾益智合剂能减轻2－VO诱导的行为学改变、海马神经元形态学改变，减少海马神经元凋亡，最终改善认知功能。说明薯蓣健脾益智合剂能有效保护VaD模型认知功能。

本研究结果显示，模型组海马神经元凋亡率均高于正常组，且MEKK2、MEKK3、MEK5和ERK5表达下降，由此可见，大鼠的海马神经元凋亡与ERK5信号传导等因子的减少有关。有研究表明，ERK5可在海马与嗅球成年神经发生［13］。ERK5对氧化应激敏感，并调节氧化应激组织中的细胞凋亡和炎症，尤其是心脑血管系统中的细胞凋亡和炎症［14］，且ERK5信号级联对正常心脑血管发育和血管完整性至关重要［15－16］。此外，体外实验研究表明，在正常内皮细胞中，ERK5是防止凋亡、介导剪切应力信号、调节缺氧和细胞迁移所必需的［17］。ERK5是MEK5已知的唯一靶点，因此为信号整合创造了一个独特的轴［18］。反过来，上游MEKK2和MEKK3经磷酸化后，MEK5的激活被触发［19－20］。而ERK5介导的信号传导是由多种细胞外刺激引起的，包括氧化应激、渗透应激、缺氧缺血条件、促炎细胞因子［21］。因此，在脑缺血损伤期间激活ERK5可防止缺血大鼠海马CA1区的细胞凋亡［22］，与本研究结果相符。本研究结果提示，治疗组ERK5信号传导等因子水平明显上调，显示薯蓣健脾益智合剂可能通过调节ERK5信号传导等因子的升高，起到抗凋亡的作用，进而保护VaD大鼠神经元。

薯蓣健脾益智合剂是由湖北省中医院已故名医吕继端教授所创立，主要由经典名方薯蓣丸化裁而来。全方由熟地黄、枸杞、杜仲、何首乌等具有补肾益脑、填精益髓、化痰祛瘀等功效的药物组成，诸药合用，使脏腑气血得生，阴阳得平，可从健脾益髓、开窍益智等方面有效缓解认知功能障碍。现代药理学研究证实薯蓣健脾益智合剂中多种药物存在有效药理成分，芍药中芍药苷具有调节蛋白质、调节神经递质、保护神经元的作用，能有效降低促凋亡因子，阻止神经细胞凋亡［23－25］。石菖蒲挥发油亦可有效抑制神经细胞凋亡［26］，通过降低脑组织兴奋性递质，从而改善痴呆大鼠学习记忆能力［27］。党参中人参皂苷能提高学习和记忆功能，其机制可能与促进脑组织蛋白有关［28］。由此可见，薯蓣健脾益智合剂可通过多种有效成分，多方面阻止并逆转神经元凋亡，缓解临床症状。

综上所述，薯蓣健脾益智合剂能有效抑制VaD大鼠海马神经元凋亡，改善VaD大鼠的认知功能障碍，其具体机制可能与升高ERK5相关信号传导蛋白的表达，抑制神经元凋亡的作用相关。

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（收稿日期：2022－09－27）

（本文编辑郭怀印）

基金项目 国家中医药管理局基金项目（No.JY/CACM002－2019）；湖北省自然科学基金重点项目（No.2015CFA089）

通讯作者 李鸣，E－mail：385579@qq.com

引用信息 刘煜，李鸣，吴永贵，等.基于ERK5信号通路探讨薯蓣健脾益智合剂对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（1）：68－74.