载神经毒素的透明质酸可溶性微针制备、评价及镇痛作用研究

吴 婷 钟家浩 姚文栋

神经毒素（neurotoxin，NT）是一种从眼镜蛇毒中分离的多肽，具有镇痛、抗炎、抗衰老及免疫抑制等作用[1-3]，现已有肌内注射剂上市[4]。相较于传统的镇痛药，NT 长期应用无成瘾性与耐受性，不但可应用于急性疼痛，还可应用于晚期癌痛、类风湿性关节炎等[3-4]。可溶性微针（dissolving microneedle，DMN）是一种由可生物降解的水溶性聚合物组成的微针，用于透皮递送水溶性药物[5]。通常将水溶性药物封装在DMN 的针头部分，一旦穿过角质层，由生物相容性聚合物构成的针体在接触组织液后就会溶解，从而释放出包封的化合物。除了微针的其他优点外，DMN还具有成本低廉，可以完全溶解针头，不引起二次危害的优点[6]。本研究采用两步离心法以高生物相容性材料——透明质酸（hyaluronic acid，HA）作为针体材料，羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）作为背衬材料，制备载神经毒素的可溶性微针（DMNNT），通过对DMN-NT 体内外的评价，为分子量较大的多肽类药物以及镇痛药物经皮递送提供参考。

1 实验材料

1.1 仪 器 微针模具，台州薇凯生物科技有限公司；HF-50 数显推拉力计，美国PACK 公司；B008 便携式显微镜，深圳超眼科技有限公司；TL6R 立式离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；Nikon Eclipse Ci-L 正置显微镜，日本尼康株式会社；YLS-12A 鼠尾光照测痛仪，山东省医学科学院设备站；Waters Alliance e2695 高效液相色谱仪，美国Waters 公司。

1.2 试 剂 NT，云南龙凤谷生物药业有限公司，批号H45021228；HA，上海艾伟拓医药科技有限公司，批号42122；CMC，国药集团化学试剂有限公司，批号C10085620；其余试剂均为分析纯。

1.3 动 物 健康SPF 级的6 周龄ICR 小鼠72 只（雄27 只、雌45 只），体质量（20±2）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，饲养于SPF 屏障系统中，食物充足，光照条件为12 h 明暗交替，温度20～22 ℃，相对湿度40%～70%，动物许可证号：SYXK（浙）2021-0012，按照浙江中医药大学动物饲养规则和使用指南进行饲养及应用，实验后颈椎脱位处死。

2 方 法

2.1 DMN-NT 的制备 在前期工作基础上，采用两步离心法制备DMN-NT[6-7]。（1）加入NT 水溶液调节HA 浓度分别为10、20、30、40 mg/mL，搅拌均匀后将含药的HA 液注入微针模具；在4 ℃，4 000 r/min 离心10 min，除去微针模具表面的HA 液，干燥1 h 后取出备用；（2）称取CMC 溶胀为水溶液（4%），注入含干燥定型HA 的模具，离心10 min，取出后干燥成型，脱模，即得DMN-NT。DMN-NT 的机械强度通过使用拉力计测得的纵向与横向断裂力体现。以机械强度为指标，筛选制备DMN 最合适的HA 浓度。

2.2 表 征

2.2.1 形态特征 将所制备的DMN-NT 置于便携式显微镜下观察其形态；在正置显微镜下观察形态并记录微针的长度及宽度。

2.2.2 载药量 将DMN-NT 溶于去离子水（1 mL）中，在充分溶解后离心，随后取上清液，采用前期研究中的HPLC 法检测每片载药量[7]。

2.2.3 稳定性 取制得的DMN-NT 在室温、4 ℃、-20 ℃条件下分别保存1 周及1、3 个月后，测定其剩余载药量。

2.3 体外透皮释放度 按前期研究处理得到无毛的离体鼠皮并设置扩散池相应条件，随后DMN-NT 透皮给药[7]；分别于DMN-NT 透皮给药0、10、20、30 min和1、2、3、4、6、8 h 收集0.5 mL 接收液，随后补充等量接收液。对取出的接收液处理后，用高效液相色谱法测定含量并计算累计释放率。

2.4 药效学

2.4.1 醋酸扭体法镇痛试验 取36 只小鼠，雌雄各半，将其随机数字表法分成生理盐水（normal saline，NS）组、NT 组、DMN-NT 组；每组又分为1 h 与4 h 两个亚组，每组6 只。按组分别给药，NT 组肌肉注射NT 溶液（100 μg/kg），DMN-NT 组使用DMN-NT 透皮给药，每片（2.2±0.2）μg；NS 组肌肉注射与NT 组等量的NS。给药后1、4 h 每只小鼠按10 mL/kg 剂量腹腔注射0.6%醋酸，观察并记录30 min 内小鼠的扭体次数。

2.4.2 热板法镇痛试验 设定温度为（55±0.5）℃，以舔足或跃起时间为痛阈指标，筛选出基础痛阈在10～30 s 内的雌性小鼠18 只。为避免组织损伤，设定60 s 为加热的上限。将筛选出的18 只小鼠随机数字表分成NS 组、NT 组、DMN-NT 组。按组给药，随后分别测定在30、60、90、120、180、240、480、720 min 的痛阈值变化。

2.4.3 鼠尾测痛法镇痛试验 筛选出基础痛阈在5～10 s 内的小鼠18 只，雌雄各半，分层随机数字表分为NS 组、NT 组、DMN-NT 组。为避免组织损伤，设定16 s 为持续加热的上限。按组给药，分别测定给药后30、60、90、120、180、240、480、720 min 的痛阈值变化。

3 结 果

3.1 DMN-NT 的制备 所得DMN-NT 机械强度如表1 所示，随HA 浓度的升高，所制备DMN-NT 机械强度升高；HA 浓度30 mg/mL 时，机械强度达到最大值，纵向断裂力为（0.173±0.004）N，横向横向断裂力为（0.598±0.042）N。然而HA 浓度40 mg/mL 时，由于浓度过高，影响DMN 成型，无法制备得到形态标准的DMN。

表1 不同浓度HA 对DMN-NT 机械强度的影响（N，±s）

表1 不同浓度HA 对DMN-NT 机械强度的影响（N，±s）

注：HA 为透明质酸；DMN-NT 为载神经毒素的可溶性微针；“-”为无此项结果

HA 浓度（mg/mL）10 20 30 40横向断裂力0.412±0.031 0.545±0.046 0.598±0.042-DMN-NT 片数6666纵向断裂力0.148±0.004 0.165±0.005 0.173±0.004-

3.2 表 征 结果如图1 所示，DMN-NT 针体呈金字塔形，表面平整，长度约为500 μm，底部宽度约为350 μm。所得每片DMN-NT 载药（2.2±0.2）μg。稳定性结果如表2 所示，随保存时间的延长，不同保存条件下的DMN-NT 剩余载药量均有所下降。而相同保存时间下，低温更有利于NT 的保存，-20 ℃条件下DMN-NT 保存3 个月仍有（98.4±1.8）%的剩余载药量。由此可知，DMN-NT 冷冻保存稳定性较为良好。

图1 便携式显微镜（4×，A）与正置光学显微镜观察DMN-NT表观形态（100×，B）

表2 DMN-NT 在不同条件下的稳定性（%，±s）

表2 DMN-NT 在不同条件下的稳定性（%，±s）

注：DMN-NT 为载神经毒素的可溶性微针

温度-20 ℃4 ℃室温DMN-NT 片数剩余载药量666 1 周100.2±1.8 100.5±2.0 99.8±2.1 1 个月99.8±1.5 99.2±2.2 99.0±2.7 3 个月98.4±1.8 96.5±1.5 95.2±2.0

3.3 体外透皮释放度 根据释放时间及通过计算处理后累计释放率，绘制药物的累积渗透曲线。结果如图2 所示，前10 min 释放较慢，累计渗透百分比约为10%；20～30 min DMN 中的NT 释放较快，在20 min时已有33%累积渗透，而30 min 后透过离体皮肤的NT 累积释放率已高于60%。并且，在2 h 后基本释放完全，3 h 基本达到最大值95%。

图2 DMN-NT 累积渗透曲线

3.4 药效学

3.4.1 醋酸扭体法镇痛试验 如表3 所示，与NS 组比较，NT 组及DMN-NT 组小鼠不同时间点的扭体次数均显著减少（P＜0.01）。1 h 时，DMN-NT 组小鼠的扭体次数显著高于NT 组（P＜0.01）；4 h 时，DMNNT 组的扭体次数显著低于NT 组（P＜0.01）。

表3 各组小鼠醋酸扭体法镇痛试验结果比较（次，±s）

表3 各组小鼠醋酸扭体法镇痛试验结果比较（次，±s）

注：NS 为生理盐水；NT 为神经毒素；DMN-NT 为载神经毒素的可溶性微针；与NS 组比较，aP＜0.01；与NT 组比较，bP＜0.01

组别NS 组NT 组DMN-NT 组鼠数666 1 h 60.12±9.06 30.13±2.91a 37.38±3.56ab 4 h 60.25±8.96 39.64±3.52a 33.15±3.18ab

3.4.2 热板法镇痛试验 结果如图3 所示，与NS 组比较，NT 组及DMN-NT 组在给药后30～480 min 的痛阈均显著升高（P＜0.01）。但NT 组在30～90 min 的痛阈显著高于DMN-NT 组，表明肌肉注射的起效时间比微针透皮快。但在240～480 min，DMN-NT 组的痛阈显著高于NT 组，显示微针透皮给药延长了NT的作用时间。

图3 各组小鼠热板法镇痛试验结果

3.4.3 鼠尾测痛法镇痛试验 鼠尾测痛法结果（见图4）与热板法结果类似，与NS 组比较，NT 组在30～240 min 的痛阈显著升高（P＜0.01），DMN-NT 组在给药后30～480 min 的痛阈显著升高（P＜0.01）。NT 组在30～90 min 的痛阈显著高于DMN-NT 组；但在180～480 min，DMN-NT 组的痛阈显著高于NT 组，再次验证了NT 经DMN 封装后透皮给药延长了NT 的作用时间。

图4 各组小鼠鼠尾测痛法镇痛试验结果

4 讨 论

NT 主要通过与胆碱能受体结合，发挥镇痛疗效，但其对外周也具有明显的镇痛作用[1]。目前NT 临床制剂主要采用肌肉注射给药，造成患者注射部位的疼痛；而慢性疼痛的反复注射更降低了患者依从性，在有替代药物时，不作为优先考虑，限制了其临床应用。DMN 以穿刺形式在角质层形成通道；DMN随后接触组织液，针体在皮肤中逐步溶解，释放包封在针体的药物并发挥疗效[5-6]。即使是分子量在6900左右的NT 也能通过DMN 实现透皮递药。

DMN 主要由高水溶性的生物相容性材料构成。与其他类型的微针（例如固体、水凝胶、包被的和空心的微针）比较，DMN 不会在皮肤上留下生物危害残留物[8-9]。HA 是一种广泛分布于细胞外基质的黏多糖，具备优越的生物相容性及生物可降解性[10]。HA无免疫原性，在润滑关节、促进伤口愈合、调节血管通透性、抑制炎症等生理功能方面具有重要意义[11]。因此，以HA 作为微针材料，不仅保证了生物安全性，还可加速皮肤微孔道愈合[12]。由于皮肤的弹性与异质性，微针针头应具备极佳的成形性与机械强度以确保能顺利穿过角质层且不变形[6]。HA 的浓度直接影响到DMN 机械强度，本研究考察不同浓度HA 制备得到DMN 的机械强度，确定了最佳制备浓度。在前期工作基础上，我们确定了CMC 作为背衬材料可以保证DMN 柔韧性[7]。制备的DMN 主要为金字塔形，这种结构相对常见的圆柱状、圆锥状微针，针体更为稳固，不易在给药过程出现断针等现象[7，13]。微针的载药量目前仍主要通过NT 浓度调节。本次主要用于ICR 小鼠镇痛，根据小鼠常用量（100 μg/kg）及体质量（20±2）g 换算的小鼠肌注给药量应为（2.0±0.2）μg。微针给药类似于皮下注射，给药量应略高于肌注，DMN-NT 最终载药量为（2.2±0.2）μg，可以满足小鼠镇痛给药剂量。HA 制备的微针初期释放较慢，这可能是由于微针针体材料释药有一个溶胀-释放过程[6，14]。随后DMN 释放较快，2 h 基本释放完毕。DMN释药速率与制备材料有关，如硫酸软骨素制备的微针在45 min 内基本释药完全[15]，而PVP 制备的微针相对释药较为持久[7，16]，HA 制备的DMN 释药速度相对较快。

本研究的镇痛试验从外周镇痛（醋酸扭体法）和中枢镇痛（热板法与鼠尾测痛法）全面考察DMN-NT的镇痛作用[17-18]。醋酸扭体研究结果表明，相比于NT组，小鼠4 h 后扭体次数明显下降（P＜0.01），DMNNT 组作用时间明显延长，但DMN-NT 组在1 h 时的药效不如NT 组（P＜0.01），表明DMN 透皮给药起效时间久于肌肉注射。热板法中，30～90 min NT 组小鼠痛阈明显高于DMN-NT 组（P＜0.01）；而在240～480min，DMN-NT 组痛阈明显高于NT 组（P＜0.01），DMN 的缓释作用使其镇痛作用延长。但NT 组的最高痛阈较DMN-NT 组高，表明肌肉注射在初期起效剂量更多，DMN-NT 释放持续而缓慢。鼠尾测痛试验显示，NT组与DMN-NT 组相较NS 组也均展现明显的镇痛作用，但在具体时间上有所差异，总体趋势结果与热板法类似。

综上所述，NT 经DMN 负载后可以实现无痛透皮给药；相比于肌肉注射，DMN-NT 可以提高患者依从，在不改变镇痛效果的情况下，延长镇痛作用时间。