IL-1β+3953基因多态性与2型糖尿病伴发牙周病关系的研究*

高秀秋,石 铁,杜 暘,李 波

(1.辽宁医学院 附属第二医院，辽宁 锦州 121001； 2. 辽宁医学院 口腔医学院 口腔内科，辽宁 锦州121004)

牙周病是为糖尿病的重要合并症之一，糖尿病与牙周病之间呈双向关系，糖尿病可以增加牙周病的发病风险，血糖增高是慢性牙周炎的危险因素[1]。而血糖的良好控制能促进牙周的康复。了解糖尿病的牙周并发症的危险因素已成为糖尿病防治工作的重点。研究表明，白细胞介素-1β(IL-1β)在不同时间和空间的表达启动、控制着牙周病的形成[2，3]，本实验旨在研究IL-1β+3953基因多态性与2型糖尿病伴发牙周病的关系。

1 资料与方法

1．1 病例选择

患者均为辽宁医学院附属医院口腔及内分泌科室门诊病人， 共 90例，其中男49例，女41例，年龄34～72岁。

糖尿病患者符合以下条件：患者被诊断为2型糖尿病1年以上，血糖水平超过正常范围，无其他严重全身疾病及并发症，经体检无呼吸、消化、泌尿、生殖系统或身体其他部位的炎症感染，糖尿病状况及用药量近期无明显变化。

糖尿病患者伴牙周病入选标准：全身情况良好，无严重糖尿病并发症，无身体其他部位感染；口内预留牙数不少于15颗；至少有2个位点附着丧失超过4 mm，探诊深度超过4 mm；X线显示多个位点牙槽骨吸收超过根长的1/3；至少半年内未接受任何牙周治疗。

所有人员均为长期居住在辽宁地区的汉族人群，均了解本次试验的目的并签字同意参与。

1.2 方 法

1.2.1 样本采集和DNA提取：取研究对象前臂静脉血 2 mL ,0.5 mol/L EDTA 抗凝,保存 -70℃冷室备用。血样本抽提DNA，用低渗法破除红细胞，在蛋白酶K及SDS的作用下37℃消化过夜。等体积酚氯仿抽提去除蛋白，最后乙醇沉淀析出基因组DNA溶于TE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCI,1 mmol/L EDTA,pH = 8.0)中，4℃保存。用UV-240紫外分光光度自动记录仪测定DNA样品在 260 nm 和 280 nm 处的吸光度(A值)，计算DNA的含量和判断DNA纯度。IL-1β+3953 多态性目的基因片段扩增和酶切分析[4]。

1.2.2 PCR反应体系：DNA模板2 μL，dNTP 2 μL,10×缓冲液2 μL，BSA 2 μL，顺义引物为5′-CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAAA-3′和反义引物为5′-GCTTTTTTGCTGTGAGTCCCG-3′各0.5 μmol/L，2.5 μmol/L Mg2+1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U，无菌去离子水补足体积至20 μL。循环参数94 ℃ 5 min，30×(94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 5 min。

扩增产物经电泳分析证实PCR扩增成功，然后取PCR产物5 μL，TaqI限制性内切酶3 U，10×酶切缓冲液1 μL，无菌去离子水补足体积至10 μL，混匀，65 ℃水浴过夜，取酶切产物4 μL作7% PAGE电泳，硝酸银法染色后读取结果，证实酶切彻底[5]。

1．3 统计学方法

结果用SPSS12.0统计软件包处理。所有数据用均数±标准差来表示，运用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析处理。检验水平在P<0.05时认为差异具有显著性意义。

2 结 果

2.1 受试人群的性别与年龄情况

受试者年龄范围为34～72岁(表1),平均年龄为53.32 岁。男性49 名,女性41 名,男女性别所占受试者比率分别为54%和46%.其中37%的受试者在近1年内接收过牙科检查。糖尿病患者的平均患病年龄为9.4 年。接近93%的受试者平均刷牙1次/d。有3%的受试者有用牙线的习惯，43%的受试者有饭后用牙签剔牙习惯。吸烟或有过吸烟经历的受试者有27名。有6名受试者在2年内有洗牙史。

表1 受试人群的性别与年龄

2.2 受试人群牙周炎情况

对单纯的牙周炎及牙周炎伴发糖尿病受试者的牙周炎情况进行比较，见表2。单纯的牙周炎患者中度牙周炎患者所占比率为53.84(n=14/26),牙周炎伴发糖尿病受试者中中度牙周炎患者所占比率为52.88% (n=11/21)。

表2 受试人群牙周炎程度 n(%)

2．3 基因型测定电泳结果

受试者血中提取的PCR产物与TaqI限制性内切酶混合过夜，酶切产物于12%的PAGE凝胶电泳，EtBr染色后读取结果。出现3个酶切片段135 bp，114 bp，249 bp的为I/II基因型，只出现135 bp，114 bp片段的为I/I基因型(图1)。

图1 PAGE凝胶电泳图

2.4 对所有受试者的IL-1β+3953基因型进行分析

牙周健康人群中的IL-1β+3953基因的I/II型的比例占所有健康受试者的5%,而糖尿病与慢性牙周炎的的IL-1β+3953基因的I/II型的比例占同类受试者的8.70%(P<0.05)和11.54%(P<0.05),与健康组进行比较,L-1β+3953基因的I/II型的比例增加3.70%和6.54%,这表明IL-1β+3953基因的I/II型与糖尿病及牙周炎的发生有一定的统计学意义。慢性糖尿病伴发牙周炎的患者的IL-1β+3953基因的I/II型的比例为14.29%(P<0.05) 与健康组进行比较,L-1β+3953基因的I/II型的比例增加9.29%,且明显高于单发的糖尿病或牙周炎患者,这表明在糖尿病患者具有IL-1β+3953 I/II的基因型会进一步增加牙周炎的患病概率。

表3 IL-8β+3953/Taq基因型在受试者中的分布

1)与健康组相比P<0.05

3 讨 论

目前，对于牙周病的研究已经深入到分子生物学水平，研究发现牙周病的形成是一个复杂的微生物学、组织学、生物学、内分泌学的动态过程，是细胞、细胞外基质、细胞因子、基因及外界因素综合作用和网络调控的结果[6，7]。一项研究结果表明[8],在2型糖尿病情况下,高血糖与IL-1β的升高有着密切的联系,在2型糖尿病患者发生某些器官的感染时,会释放大量的免疫因子,包括IL-1β和肿瘤坏死因子.在IL-1β的基因型多样性存在情况下,会促使IL-1β诱导的某些细胞因子分泌增加。糖尿病患者在IL-1A基因多态型存在可以使牙周炎的患病几率增加3倍。另外有报道提出[9],2型糖尿病的患者对血液中的细胞因子的易感性明显增加。这也就解释了在糖尿病患者在具有IL-1β+3953I/II型基因时导致患牙周炎的几率增加。

本研究显示，IL-1β+3953等位基因II型的存在与牙周炎及糖尿病的发生具有统计学意义,在糖尿病患者中具有IL-1β+3953等位基因II的人群伴发牙周炎的概率明显增高。因此 ，分析IL-1β+3953等位基因与2型糖尿病伴发牙周病的相关关系，寻找和建立有效的糖尿病合并牙周炎的发病风险预测和发病前诊断技术，在临床上具有重要实用价值，这对早期发现和及时防治糖尿病合并牙周炎有着十分积极的临床意义。

[1] 王琳源，高秀秋.糖尿病与牙周病关系的研究进展[J].医学研究杂志,2008,37(7)：98.

[2] Ikuyo Ikezawa,Hideaki Tai,Yasuko Shimada,et al.Imbalance between soluble tumour necrosis factor receptors type 1 and 2 in chronic periodontitis[J].J Clin Periodontol,2005,32(10):1047-1054.

[3] Aljada A, Gard R, Ghanim H, et al. Nuclear factor-kB suppressive and inhibitor-kB stimulatory effects of troglitazone on obese patients with type 2 diabetes evidence of an anti-inflammatory action[J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86(7):3250-3256.

[4] 杨忠伟，冯秀丽，梁晓安，等. 新疆地区汉族血管紧张素转换酶基因多态性与冠心病相关性研究[J].中国老年学杂志,2009,21(11)：2718-2719.

[5] 安喆,毕磊,郑柳颖,等. 趋化因子受体CX3CR1的基因多态性与冠状动脉粥样硬化的相关性研究[J].大连医科大学学报,2008,30(4):314-317.

[6] 张源明,钟良军,古丽波斯坦·吐尔逊，等. 白细胞介素-1β-511基因型与慢性牙周炎和冠心病相关性的研究[J].新疆医科大学学报,2004,27(03)：202-204.

[7] 周昊，梁新华.RNA干扰技术在口腔医学领域应用的研究进展[J].国际口腔医学杂志，2008，35(5)：565- 568.

[8] 路春，朱鸿，施彩虹.早期糖尿病视网膜病变患者血清相关细胞因子的检测[J].上海交通大学学报：医学版，2009，29(9)：1053-1056.

[9] 张爱武，倪丹，董照军. 2型糖尿病患者血清IL-1β、IL-6水平检测[J].微循环学杂志，2006，16(1)：77.