高效液相色谱法测定人血清中大黄素的含量*

曹晶萍, 魏晓晴，赵 莹, 崔 颖，高 颖,2

(1.辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室，辽宁 大连 116044； 2.大连医科大学 生物化学与分子生物学教研室， 辽宁 大连 116044)

目前，已有很多文献报道HPLC法测定各种药品中大黄素的含量，但少见人体血清中大黄素浓度的测定方法。为分析大黄素在人体血清中浓度及药动学规律，本文参考有关文献[1-5]，建立了高效液相色谱法测定人体血清中大黄素的分析方法，报告如下。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Waters1525型高效液相色谱仪，Wsters2487紫外检测器，Breeze色谱管理系统，UNIVERSAL 30RF高速冷冻离心机，XH-C型旋涡混合器。大黄素标准品(中国药品生物制品检定所，批号：0756-200211)，甲醇为国产色谱纯，磷酸为国产分析纯，超纯水经微孔滤膜滤过后使用。

1.2 方 法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：Nova-Pak C18 (3.9 mm×150 mm，4 μm)。流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)，流动相均以0.45 μm滤膜过滤，超声脱气后使用。流速1.0 mL/min，柱温37℃。紫外检测器检测，检测波长254 nm。进样量：20 μL。

1.2.2 标准溶液与标准曲线：准确称取大黄素标准品适量，用甲醇溶解稀释配成含大黄素1 mg/mL的标准储备液，充氮气后放于-80℃低温冰箱保存。取大黄素标准溶液(1 mg/mL)用甲醇稀释成浓度分别为0.1、5、10、15、20 μg/mL的标准系列应用液。

1.2.3 样品的测定：取8名健康志愿者血清200 μL，置于2.0 mL带盖塑料离心管中，加入800 μL乙醚，放至旋涡混合器上震荡15 min后， 然后以-4 ℃，12000 g离心10 min。 准确吸取上层乙醚提取液400 μL移入另一2.0 mL带盖塑料离心管中。通氮气将提取液挥发干后，立即加入100 μL甲醇并盖上盖子，在旋涡混合器上震荡溶解，使残留物溶于甲醇，-4℃，12000 g离心10 min，用微量进样器吸取20 μL上清液进样分析。

1.2.4 加样回收率及精密度实验：用正常人血清适量，准确加入大黄素标准溶液，按照样品测定方法操作分析，每批样品同一天内重复测定5次，同批样品连续测定5 d。将峰面积差值代入回归方程并计算回收率和精密度

2 结 果

2.1 色谱分离

选用254 nm检测波长时，大黄素有较大吸收值，并且能与其他峰有效地分离。标准溶液和血清样本中大黄素的保留时间为4.65 min。见图1。

图1 大黄素在血清中的色谱行为A 为标准溶液色谱图；B 为人体血清中大黄素色谱图

2.2 标准曲线及检出限

取标准系列应用液分别进样测定，以浓度(X)对样品的峰面积(Y)进行回归，求得回归方程：Y=4.36e+004X+3.22e+005，相关系数r=0.9993。以基线噪音3倍峰面积对应的大黄素含量作为最底检出限20 ng/mL。

2.3 加样回收率及精密度

平均回收率为99.01%，日内相对标准偏差为2.16%，日间相对标准偏差为3.78%。

2.4 样品测定结果

取8名健康志愿者含大黄素血清，按照样品测定方法操作，以外标法计算大黄素的血清药物浓度分别为2.55、2.16、 2.09、 2.06、 1.98、 1.96、 1.80、 1.51 μg/mL，平均值为2.01 μg/mL。

3 讨 论

大黄素(Emodin)，化学名，1'3'8-三羟基-6-甲基蒽醌，分子量为270.23，来源为蓼科植物虎杖的干燥根茎和根， 掌叶大黄的根茎， 橙黄色长针状结晶。 口服大黄素在肠内易于吸收，2～3 h后血中即达最高浓度，以后慢慢下降，亦有人把它制成注射剂，用于肌肉和静脉注射。在临床上，用大黄素纯品治疗肿癌，主要用于白血病、胃癌等肿瘤，而最常用的则用于抑菌。因此，建立一种简单、快速、灵敏、稳定的人血清中大黄素的测定方法很有必要。

本实验分别使用乙醚[1]、正己烷、氯仿[2-5]为提取剂，经过实验比较发现，用乙醚提取的样品提取回收率明显高于其他两种有机试剂，且考虑到乙醚易挥发且毒性较小，故选乙醚作为提取剂。流动相选择为甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)，甲醇与0.1%磷酸溶液的比例对保留时间和分离度有影响，经实验选择两者比例为80∶20可得到较好的分离效果及合适的保留时间。

本实验研究了国内外各种方法的优点，建立了高效液相色谱法测定人体血清中大黄素的含量，实验结果证明被测组分大黄素峰形对称，无拖尾现象，无干扰，精密度也较理想，而且具有快速、灵敏、准确和重复性好等优点，故适用于人体血清中大黄素浓度的测定及药代动力学、生物利用度研究。

[1] 李兰芳，张勤增，解丽君，等.通脉活血胶囊中大黄素在大鼠血浆中的浓度及药代动力学研究[J]. 河北医药，2006，28(11)：1020-1022.

[2] 林志强. 高效液相色谱法快速测定养血安神糖浆中大黄素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2006，12(11)：26-27.

[3] 袁华峰. HPLC法测定肝炎合剂中大黄素的含量[J].药学与临床研究，2008，16(2)：155-156.

[4] 王晓宏. HPLC法测定护肝宁胶囊中大黄素[J].现代中药研究与实践，2008，22(3)：44-45.

[5] 林瑞红.高效液相色谱法测定降脂宁片中大黄素的含量[J]. 中药材，2008，31(2)：306-308.