阿尔茨海默病模型小鼠自主活动能力的分析

袁树民，张晓娟，张海涛，高 翔，高 珊，张连峰，秦 川

（中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021）

阿尔茨海默病 （Alzheimer＇s disease，AD）是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，患者出现一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，记忆性神经元数目减少，神经元纤维缠结 （neurofibrillary tangles，NFT）、以及老年斑 （senile plaque，SP）形成［1，2］。AD患者在发病的早期（1-3年），学习新事物困难，空间定向障碍，行为上表现为淡漠，偶尔出现易激惹，在第二阶段（2 -10年）患者学习记忆能力明显下降，不能计算，有时出现失语，精神上出现妄想，运动系统表现为烦躁不安；第三阶段（8-12年）患者智力严重衰退，运动系统表现为肢体强直，屈曲体位［3］。

在利用动物模型进行的AD研究中，主要侧重学习记忆能力，空间记忆能力的测试，如水迷宫实验，避暗实验，多臂迷宫实验等，目前关于阿尔茨海默病小鼠模型的自主活动能力实验的研究很少，而主活动能力的改变是阿尔茨海默病患者的特征之一。为此，我们利用 APPswePPSΔE9双转基因小鼠，通过旷场实验对阿尔茨海默病小鼠模型的自主行为特点进行了分析。

1 材料和方法

1.1 动物及设备

本实验所用的小鼠是我所构建的 APPswe/ PSΔE9双转基因小鼠（SCXK（京）2005-0013）10只、以及野生型C57P6J小鼠每组10只，雌雄各半；设备为：荷兰Noldus公司Ethovision XT监测分析软件，Morris水迷宫系统；旷场箱；水池、平台。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宫检测转基因小鼠的学习记忆能力变化：选用4、6、8月龄的转基因 APPswe/PSΔE9双转基因阳性小鼠（TG）每组10只及同月龄的野生型C57P6J小鼠（WT）每组10只，雌雄各半。利用Morris水迷宫进行小鼠学习记忆能力分析，我实验室所用的水迷宫设备为：荷兰Noldus公司Ethovision XT监测分析软件，Morris水迷宫系统 。圆形水池直径为100 cm，平台在水下0.5 cm，水温保持在22℃ ～24℃，水中加入牛奶粉，使其不透明，在水池的上方小鼠能看到的地方张贴醒目的几何图形，作为小鼠寻找平台的线索。水迷宫按东南西北分为1、2、3、4区域，平台即第5区域，位于第4区域内。水迷宫实验过程分为连续5 d的隐藏平台获得实验和第5天的空间探索实验两部分。隐藏平台获得实验时，每天在同一时间训练小鼠2次，每次使同一只小鼠在不同区域下水，而不同的小鼠在相同的位置下水，每次游泳时间60 s，找到平台，并在上面停留3 s以上者，视为找到平台，60 s内没有找到平台的要将其引导到平台上，停留15 s，小鼠没有找到平台按60 s计算潜伏期。每次训练间隔1 h左右。空间探索实验在滴体的隐藏平台实验结束1 h后立即进行，把第五去的平台去掉，让小鼠在某一点入水，主要看小鼠在平台区出现的频次。隐藏平台获得实验检测小鼠学习获得能力，空间探索实验检测小鼠空间记忆能力［4-6］。

1.2.2 旷场实验检测转基因小鼠的自主行为：水迷宫实验结束后3 d，开始进行旷场实验，所用的计算机失踪分析系统与水迷宫相同，实验箱为50×50 cm的旷场，周壁的颜色为白色（一般是与动物的颜色相反），旷场底面被分成面积相等的16块正方形格子，沿墙格称外周格，其余为中央格。将小鼠放在正中央格，用固定于旷场上方的摄象机记录动物一段时间内的行为活动情况，通过计算机示踪分析系统来分析动物在一定时间内的活动状态，时间为5 m in。实验室要保持安静，室温为20℃左右，光线充足。观察指标：方格间穿行次数（动物的四肢从一个格进入另一个格为穿行一次）、直立次数（动物双前肢同时离地，或者双前肢放在墙壁上算作直立一次）、中央格停留时间。穿过中央格的次数。研究认为，经过的格子数代表动物的兴奋性；站立的次数代表动物对陌生环境的适应能力［7］。

1.3 统计学方法

利用 spss16.0进行统计分析水迷宫实验小鼠寻找平台的潜伏期，采用重复测量数据的方差分析［8］，空间探索实验中在平台区出现的频次用单因素方差分析，旷场实验的各指标用单因素方差分析。数据采用均数 ±标准差表示，P＜0.05.被认为是有统计学差异。

2 结果

2.1 水迷宫结果

经统计学分析，在隐藏平台获得实验中，转基因模型小鼠学习记忆能力明显低于野生鼠，尤其在4月龄、6月龄差异具有显著性（p＜0.05），8月龄差异减小。（图1）空间探索实验：模型鼠的记忆能力也低于野生鼠，与隐藏平台实验相同，在4月龄、6月龄差异较明显，8月龄差异减小（图2）。

图1 不同年龄动物隐藏平台实验潜伏期分析Note：A：Comparison of the escape latency between transgenic and controlmice in age of 3 months.B：Comparison of the escape latency between transgenic and controlmice in age of 6 months.C：Comparison of the escape latency between transgenic and control mice in age of 8 months.Fig.1 Determ ination of escape latency in hidden p latform acquisition training in the mice of different ages

2.2 旷场结果

与野生组小鼠相比，模型组小鼠的活动量明显增加，模型鼠活动无规律性，经统计其活动总数，直立次数，以及在中央区出现的频率，4月龄、6月龄时，高于野生型组小鼠40％ ～70％，具有显著性差异（P＜0.05），8月龄差异减小（图3），这与水迷宫的结果相同。

3 讨论

野生小鼠与转基因模型小鼠穿越原平台区次数的比较 *：P＜0.05图2 空间探索实验穿越平台区分析Fig.2 Comparison of the numbers of transgenic and control mice crossing the removed-platform

图3 APPswe PPSΔE9与野生型小鼠旷场实验分析Note：A：Comparison of total area entries between the transgenic mice and controlmice.B： Comparison of the numbers of rears of transgenic and control mice.C：Comparison of inner/total area entries of the transgenic and controlmice.Fig.3 Comparison of the APPswe PPSΔE9 transgenic and wild type mice by open field test

根据世界卫生组织公布的数据显示：全球预计有3 700万痴呆症患者，其中绝大部分病例都是由阿尔茨海默病导致的，70岁以上AD的发病危险显著增加，可以预见在未来的50年里，AD的发病率将增加3倍。AD发病的分子机制包括：遗传因素、APP分解和Aβ的释放、游离原子团和能量代谢障碍、钙调节失衡、脂肪因素、突触和轴突改变、神经元崩解、神经胶质细胞和小胶质细胞的活化［9］。

APPswe/PSΔE9双转基因小鼠是 APP“瑞典家族”突变和PS1第9外显子缺失突变两个基因的双转基因小鼠［10］。在3月龄开始就出现学习记忆损伤。4.5月龄开始出现老年斑，9～12月龄小鼠大脑出现与阿尔茨海默病患者相似的老年斑，具有和AD相似的病理表型［11］。

临床上患者最早出现的行为方面的改变主要是记忆力明显减退、思维分析、判断能力、视空间辨别功能下降。临床患者随着病情的发展，在发病后的2～10年，患者出现空间定向障碍，不能计算，人格上出现易激惹，有患者出现妄想等精神病性症状。运动系统表现为烦躁不安。Morris水迷宫广泛用于啮齿类动物的视觉相关的空间记忆和工作记忆的测量中，但是否用于测量动物的长时间记忆还存在争议。利用Morris水迷宫测试AD小鼠模型的学习和记忆能力是进行AD机制研究和药物评价的重要工具，也是目前主要的行为学测试方法。

但是在第二阶段和第三阶段AD患者除了学习记忆能力明显下降，不能计算等学习记忆损伤之外，还出现妄想，烦躁不安，肢体强直，屈曲体位等自主运动等方面的行为特征［3］。而在AD的机制研究和药物评价的过程中，应该注意到患者出现妄想、烦躁不安、肢体强直、屈曲体位的神经病理生理方面的基础，但是由于在AD小鼠模型烦躁不安、肢体强直、屈曲体位等行为评价方法研究不多，限制了利用小鼠模型进行AD自主运动机制和药物评价的研究。旷场实验（open field test）又称敞箱实验，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为。我们利用旷场实验发现AD模型鼠活动明显增多，并且没有规律性，频繁的直立，穿越的总距离增加，一般情况下，小鼠具有趋暗的习性，在旷场实验中表现为主要在边缘区活动，而模型鼠无目的的在狂场中奔跑，中央区出现的次数明显大于正常小鼠，这也说明小鼠易激惹、烦躁不安。可以利用活动总数、直立次数以及在中央区出现的比率等几项指标反映小鼠的自主活动，并和AD小鼠病情严重程度有相关性。在一定程度上可以反映人类患者的烦躁不安，肢体强直等次能够为特征。旷场实验能够检测动物模型的自主行为变化，可以用做更广泛的药物研发实验。

［1］Dickson DW.Neuropathological diagnosis of Alzheimer＇s disease： a perspective from longitudinal clinicopathological studies［J］.Neurobiol Aging，1997，18（4 Suppl）：S21-26.

［2］Braak H，Braak E.Evolution of neuronal changes in the course of Alzheimer＇s disease［J］.JNeural Transm，1998，53（Supp l）： 127-140.

［3］ 盛树立，主编.老年性痴呆及相关疾病［M］.科学技术文献出版社，2006：75-78.

［4］Shiryaev N，Jouroukhin Y，Giladi E，et al.NAP protects memory，increases soluble tau and reduces tau hyperphosphorylation in a tauopathy model［J］.Neurobiol Dis，2009，34（2）：381-388.

［5］ Cox MM， Tucker AM， Tang J， et al. Neurobehavioral abnormalities in the dysbindin-1 mutant，sandy，on a C57BL/6J genetic background［J］.Genes Brain Behav，2009，8（4）：390 -397.

［6］Imbimbo BP，Hutter-Paier B，Villetti G，et al.CHF5074，a novel gamma-secretase modulator，attenuates brain beta-amyloid pathology and learning deficit in a mouse model of A lzheimer＇s disease［J］.Br JPharmacol，2009，156（6）：982-993.

［7］Swiergiel AH， Dunn AJ. Effects of interleukin-1beta and lipopolysaccharide on behavior ofmice in the elevated p lus-maze and open field tests［J］.Pharmacol Biochem Behav，2007，86 （4）：651-659.

［8］ 邱宏，金国琴，金如锋，等.水迷宫重复测量数据的方差分析及其在SPSS中的实现［J］.中西医结合学报，2007，5 （1）：101-105.

［9］Mattson MP.Pathways towards and away from Alzheimer＇s disease［J］.Nature，2004，430（7000）：631-639.

［10］Sherrington R.Cloning of a gene bearing m issense mutations in early-onset familial A lzheimer＇s disease［J］.Nature，1995，375 （6534）：754-760.

［11］ 宗媛媛，王晓映.APPPPS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析［J］.中国比较医学杂志，2008，18（9）：9-12.