借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞

张 晟，肖高芳，黄黎珍，那顺巴雅尔，贾俊双，姚志芳，肖 东，顾为望

（南方医科大学1.比较医学研究所暨实验动物中心；2.肿瘤研究所，广州 510515）

慢病毒属于逆转录病毒的一种，可以高效感染处于分裂期和非分裂期的细胞；借助慢病毒可将其携带的外源基因高效整合进宿主细胞基因组中，外源基因可在细胞内长期稳定表达［1］，这些优势是其它病毒介导的外源基因传递系统无可比拟的（http：//vector.bcm.edu/ Lentivirus/Lentivirus_ Vectors.htm）。

由于猪在解剖、生理、生化代谢等方面与人类的十分相似，将猪用作医学实验动物近年来呈越来越普遍的趋势，尤其是各种小型猪品系的建立，促进了这方面的发展与应用。转基因体细胞克隆猪的问世更增加了以猪作为人类疾病模型的应用；以小型猪为材料，应用转基因技术制备转基因猪人类疾病动物模型，具有广阔应用前景。南方医科大学实验动物中心顾为望教授等人［2］于2004年由西藏自治区将藏猪引种至广州，并进行风土驯化，经5年培育而成了的新的小型猪品种，并将其命名为西藏小型猪（Tibetan m iniature pig）。

本研究的目的在于分离培养西藏小型猪胎儿成纤维细胞（porcine embryonic fibroblasts，PEFs），并进而基于慢病毒介导的转基因方法将报告基因EGFP导入西藏小型猪的PEFs，以基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统，为下一步利用转基因体细胞核移植技术制备转基因西藏小型猪，进而建立相应的人类疾病动物模型打下基础；同时，该基于PEFs的外源转基因体外投递系统的建立也将为借助慢病毒介导的转基因方式将 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc四种基因导入西藏小型猪的PEFs，进而将其在体外诱导为iPS细胞，从而建立西藏小型猪的iPS细胞系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 载体：含 EGFP报告基因的慢病毒载体pFUGW由美国Carlos Lois博士惠赠［3］，慢病毒包装系统psPAX2和pMD2.G由瑞士Didier Trono博士惠赠。

1.1.2 主要试剂：质粒提取试剂盒购自 Qiagen公司。脂质体 LipofectamineTM 2000、高糖 DMEM、Opti-MEM® IMedium、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶和 DMSO等购自Invitrogen公司，培养瓶及培养板等购自 Corning公司。其余试剂为国产或进口化学纯或分析纯。

1.2 方法

1.2.1 西藏小型猪胎儿成纤维细胞制备：西藏小型猪妊娠35 d，剖腹手术取出子宫，用75％的酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，用含双抗的 PBS（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2）漂洗 2遍，放入含双抗的 PBS中。将获得的胎儿用含双抗的 PBS洗涤3次，去除头、四肢及内脏，剩余部分放入10 mm平皿中，剪成1 mm3的组织碎块，然后加入胶原酶消化液（胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic），转入50 mL离心管，在37℃水浴摇床内消化。待消化充分后，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液，离心后弃上清液，加入含20％胎牛血清的DMEM培养液，转入10 mm平皿中，于 CO2培养箱内培养（培养条件： 38.5℃、5％CO2和饱和湿度）。当原代细胞生长达80％ ～90％融合时，进行传代。先吸除旧培养液，用PBS洗涤2遍，弃 PBS并加入胰酶（0.25％trypsin +1 mmol/L EDTA·4Na）进行消化，37°C培养箱中消化约5 min，镜下观察细胞消化情况；当大多数细胞变圆，立即加入2 m L消化终止液（DMEM+10％ FBS）终止消化，然后仔细吹打细胞悬液，将细胞悬液收集至15 m L离心管中，700 r/m in离心10 m in。弃上清液后，再用培养液（DMEM+20％FBS）重悬细胞，并轻轻吹打使细胞分散均匀，传入新的培养皿中继续培养。

1.2.2 制备携带EGFP基因的慢病毒：慢病毒包装步骤参见文献［4］和 Didier Trono博士实验室推荐的操作步骤（http：//tronolab.ep fl.ch和 http：// www.lentiweb.com）。借助 LipofectamineTM2000将慢病毒载体 pFUGW 和包装质粒 psPAX2及pMD2.G转染入293FT细胞，转染48～72 h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞发光（绿色荧光）情况，待确认转染成功后，收集病毒上清，3 000～4 000 r/ min离心15 m in，4℃保存备用。

1.2.3 病毒成功包装的确认及病毒感染西藏小型猪的PEFs：将携带EGFP基因的病毒上清或浓缩的病毒加入内含西藏小型猪的 PEFs的培养板孔内，感染6～12 h后，用相应培养基替换感染液，24～48 h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光。

2 结果

2.1 胎儿成纤维细胞的获得

图1 西藏小型猪胎儿成纤维细胞 （PEFs）Fig.1 The Tibetan miniature pig embryonic fibroblasts

原代培养24 h后，可见细胞贴壁生长。经过传代培养，可获得较纯的胎儿成纤维细胞（PEFs），细胞呈梭形、三角形等，为典型的成纤维形态，胞质近中央处有椭圆形胞核。成群细胞呈现放射状、漩涡状等走势（图1）。

2.2 慢病毒载体pFUGW鉴定

pFUGW分别经Bam H I和Pst I单酶切，产物经电泳分别可见一条带和两条带，其大小与理论预测值相符（图2）。

图2 慢病毒载体pFUGW酶切鉴定Fig.2 Lentiviral vector of pFUGW identified by enzyme digestion

2.3 携带EGFP基因慢病毒的包装与慢病毒感染西藏小型猪的PEFs

慢病毒载体pFUGW与病毒包装质粒共转染293FT细胞，48 h后，倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，证明转染成功（图3）。用经低速离心收集的病毒上清感染PEFs，48 h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，预示病毒已成功生产和慢病毒成功感染PEFs，同时也表明转基因 EGFP能够正常表达；此外，对同一视野自然光和荧光下的图片进行比对，发现慢病毒高效率感染了西藏小型猪的PEFs（图 4，图3，4见彩插2）。

3 讨论

如前所叙，慢病毒可高效率感染处于分裂期和非分裂期的细胞，这些优势是其它病毒介导的外源基因投递系统无可比拟的。为此，本研究针对西藏小型猪胎儿成纤维细胞成功建立了慢病毒介导的体外感染体系，这为接下来借助慢病毒将不同目的基因导入西藏小型猪的 PEFs奠定了基础；基于携带外源转基因的PEFs提供的细胞核可利用转基因体细胞核移植技术制备转基因克隆西藏小型猪，进而基于它建立相应的人类疾病模型动物模型［5］。

此外，目前，通过逆转录病毒、慢病毒和腺病毒介导的转基因方式均可将重编程因子基因（如Oct4、Sox2、K lf4和 c-Myc）导入人和动物的体细胞（如胚胎和成体的成纤维细胞），进而将其在体外重编程为诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）；iPS细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体 （Embryoid bodies，EBs）形成、畸胎瘤（teratoma）形成和嵌合体（chimeras）形成（针对动物）等方面与胚胎干细胞（ES细胞）的非常相似；iPS细胞研究不仅具有重要理论意义，而且 iPS细胞在再生医学、组织工程和药物发现与评价等方面极具应用价值［6］。而针对西藏小型猪的PEFs建立的慢病毒介导的体外感染体系将为借助慢病毒介导的基因投递系统将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子基因导入西藏小型猪的PEFs，进而将PEFs在体外诱导为 iPS细胞，从而建立西藏小型猪的 iPS细胞系，该细胞系将为开展干细胞与再生医学研究和基于西藏小型猪iPS细胞系建立转基因猪或基因敲除猪奠定良好基础。

［1］Cockrell AS，Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors［J］.Mol Biotechnol，2007，36（3）：184-204.

［2］ 顾为望，刘运忠，唐小江，等.西藏小型猪血液生理生化指标的初步研究［J］.中国实验动物学报，2007，15（1）：60 -63.

［3］ Lois C，Hong EJ，Pease S，et al.Germ line transm ission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors［J］.Science，2002，295（5556）：868-872.

［4］ 贾俊双，孙妍，肖东，等.慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立［J］.热带医学杂志，2008，8（10）：1028-1029，1037.

［5］Vodicka P，Smetana K Jr，DvoránkováB，et al.The miniature pig as an animal model in biomedical research.［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1049：161-71.

［6］ 申红芬，姚志芳，贾俊双，等.诱导性多潜能干细胞 （iPS cells）：现状及前景展望［J］.生物化学与生物物理进展，2009，36（8）：950-960.