远志对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经的保护作用

马洪伟，付秀美，付文亮，和亚强，陈志宏，薛景凤

（承德医学院 人体解剖学教研室，河北 承德 067000）

远志对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经的保护作用

马洪伟，付秀美，付文亮，和亚强，陈志宏，薛景凤

（承德医学院 人体解剖学教研室，河北 承德 067000）

目的 探讨远志对糖尿病周围神经病变（DPN）大鼠坐骨神经的保护作用。方法 雄性Wistar大鼠随机分为4组，正常对照组、DPN模型组、远志治疗组和远志预防组，每组12只。DPN模型组、远志治疗组和远志预防组大鼠均建立链脲佐菌素致糖尿病（DM）大鼠模型。待DM模型建立后，远志预防组大鼠给予远志（生药2.7g·kg-1·d-1）灌胃6周；DPN模型组和远志治疗组大鼠以尾部感觉神经传导速度（SNCV）＜30m/s为标准建立DPN大鼠模型后，DPN组大鼠不再做任何处理，远志治疗组大鼠给予同等剂量远志灌胃6周。测定各组大鼠尾部SNCV，紫外分光光度法测定坐骨神经醛糖还原酶（AR）活性，免疫组织化学方法观察坐骨神经神经丝蛋白（NFP）的表达。结果 与正常对照组比较，DPN模型组大鼠尾部SNCV明显降低（P<0.01），坐骨神经AR活性明显增强（P<0.01）、NFP表达明显降低（P<0.01）；与DPN模型组比较，远志治疗组与远志预防组大鼠尾部SNCV明显提高（P<0.01），坐骨神经AR活性明显减弱（P<0.01）、NFP的表达明显升高（P<0.05）。结论 远志可通过提高大鼠尾部SNCV、降低坐骨神经AR活性、上调坐骨神经NFP的表达，发挥对DPN大鼠坐骨神经的保护作用；且远志预处理对DM大鼠坐骨神经损伤具有预防作用。

远志；糖尿病周围神经病变；坐骨神经

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病（diabetic mellitus，DM）最常见的慢性并发症之一，发病率高达47%～91%，以四肢远端感觉异常或（和）运动障碍为主要临床表现。DPN可累及任何神经，且感觉神经多先于运动神经受损。DPN的发病机制迄今尚未明确，临床上缺乏确切有效的治疗药物。近年来，中药多靶点治疗疾病受到越来越多的关注。远志（Polygala）为远志科多年生草本植物，以干燥根入药，始载于《神农本草经》，被视为养命要药，有益智强志之功效。以往的研究证实中药远志对中枢神经系统具有保护作用［1～3］，但关于远志对周围神经系统影响的国内外报道甚少。本研究拟建立DPN动物模型，通过观察远志对DPN大鼠尾部感觉神经传导速度（sense nerve conduction velocity，SNCV）、坐骨神经醛糖还原酶（aldose reductase，AR）活性和神经丝蛋白（neurofilament protein，NFP）表达的影响，深入探讨远志对周围神经系统的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂

远志水煎液由中药远志浸泡、煎煮、过滤、浓缩而成（1g生药/ml）；血糖检测试剂盒由保定长城临床试剂有限公司提供，批号20090511；BCA蛋白定量试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；链脲佐菌素（streptozocin，STZ）和DL-甘油醛购于美国Sigma公司；NADPH购于瑞士Roche公司；鼠抗NFP抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；SP免疫组化试剂盒购于北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 实验动物分组及处理

成年雄性Wistar大鼠48只，体质量（200±20）g，由河北医科大学动物中心提供（合格证号：905075）。随机分为4组：正常对照组、DPN模型组、远志治疗组和远志预防组，每组12只。正常对照组大鼠常规饲养，不做任何处理；DPN模型组、远志治疗组和远志预防组大鼠均连续腹腔注射2%STZ（用pH4.4枸橼酸盐缓冲液稀释，25mg/kg，3d），1周后以血糖（blood glucose，BG）≥16.7mol/L作为 DM成模标准。待DM模型建立后，远志预防组大鼠给予远志（生药 2.7g·kg-1·d-1）灌胃 6周；DPN模型组和远志治疗组大鼠继续饲养6周后，检测大鼠尾部SNCV，以尾部SNCV＜30m/s为DPN大鼠成模标准，待DPN模型成功建立后，DPN组大鼠不再做任何处理，远志治疗组大鼠给予远志（生药 2.7g·kg-1·d-1）灌胃6周。

1.4 检测BG

各组大鼠用药结束后禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血1ml于EP管中，3000r/min离心20min，收集血清，采用葡萄糖氧化酶法检测BG。

1.5 测定尾部SNCV

4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定，保持室内温度25℃，分别用温水、75%乙醇清洁大鼠尾部皮肤。将一对刺激电极（负极位于正极近心侧）插入大鼠尾部远端皮下，两电极间隔0.5cm，依次将记录电极Ⅰ和记录电极Ⅱ插入大鼠尾部近端皮下，其中记录电极Ⅰ在刺激电极负极近心侧3cm处，记录电极Ⅱ在记录电极Ⅰ近心侧4cm处，再将参考电极Ⅰ、Ⅱ分别插入距记录电极Ⅰ、Ⅱ近心侧0.5cm处皮下，最后将接地电极插入刺激电极负极与记录电极Ⅰ之间。采用RM6240C型多道生理信号处理系统测定各组大鼠尾部SNCV，重复给予刺激3次，每次间隔30s，取平均值。尾部SNCV（m/s）=两记录电极之间的距离/动作电位潜伏期时间差。

1.6 测定坐骨神经AR活性

大鼠取血后断头处死，迅速分离并取出双侧坐骨神经（在膝关节上方取长约4cm的坐骨神经干），一侧入Bouins液固定，一侧入液氮保存。

取坐骨神经，用预冷的 PBS（0.01mmol/L，pH7.2～7.4）冲洗后，按1∶4加入预冷的PBS制成组织匀浆，4℃、12000r/min离心40min，上清即为酶粗提取液，以BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度。AR活性测定以DL-甘油醛为底物，反应体系为0.1mol/L磷酸缓冲液 ［内含 0.4mol/L（NH4）2SO4，pH6.2］，0.08mmol/LNADPH，5mmol/LDL-甘油醛，5μl酶粗提取液，使反应体积为100μl。反应自加入底物开始，37℃水浴反应5min，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液100μl终止反应，采用DU800紫外分光光度计测定NADPH在340nm吸光值。1个单位（U）AR活性定义为1min内1μmol NADPH被氧化的酶量，AR活性用U/mgprot表示。

1.7 检测坐骨神经NFP表达及数据处理

取Bouins液固定的坐骨神经，常规脱水、透明、石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。SP免疫组织化学染色法观察坐骨神经NFP的表达。鼠抗NFP一抗稀释浓度为1∶50，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。以坐骨神经轴索中出现棕黄色颗粒为NFP阳性产物。

采用MiVnt图像分析系统在10×20倍显微镜下对免疫组化阳性结果进行定量分析，每组随机选取6个大鼠坐骨神经标本，每个标本选取3张切片，以免疫阳性产物面积占视野面积的比值作为NFP的相对表达水平，取平均值。

1.8 统计处理

2 结果

2.1 大鼠BG的变化

DPN模型组大鼠BG明显高于正常组（P＜0.01）；远志治疗组和远志预防组大鼠BG明显低于DPN模型组（P＜0.01）。见表1。

2.2 大鼠尾部SNCV的变化

与正常组大鼠比较，DPN模型组大鼠尾部SNCV明显降低（P＜0.01）。远志治疗组和远志预防组大鼠尾部SNCV明显高于DPN模型组（P＜0.01）。见表1。

2.3 大鼠坐骨神经AR活性的变化

DPN模型组大鼠坐骨神经AR活性明显高于正常组大鼠（P＜0.01），远志治疗组和远志预防组大鼠坐骨神经AR活性明显低于DPN模型组（P＜0.01）。见表2。

表1 各组大鼠BG和SNCV（±s）Tab.1 BGand SNCVof the rats in each group（x ±s）

表1 各组大鼠BG和SNCV（±s）Tab.1 BGand SNCVof the rats in each group（x ±s）

1）Vs normal control group，P ＜ 0.01；2）Vs DPNmodel group，P ＜ 0.01.

Group n BG（mmol/L） SNCV（m/s）Normal control group 12 7.53±1.31 36.57±2.08DPNmodel group 12 25.40±4.221） 27.45±1.161）Polygala treatment group 12 17.20±4.562） 33.20±1.092）Polygala prevent group 12 15.80±5.602） 33.01±1.982）

表2 大鼠坐骨神经AR活性和NFP表达（±s）Tab.2 ARactivity and NFPexpression on sciatic nerve of rats（x ±s）

表2 大鼠坐骨神经AR活性和NFP表达（±s）Tab.2 ARactivity and NFPexpression on sciatic nerve of rats（x ±s）

1）Vs normal control group，P ＜ 0.01；2）Vs DPNmodel group，P ＜ 0.01；3）Vs DPNmodel group，P ＜ 0.05.

Group n ARactivity（U/mgprot） NFPexpression Normal control group 12 0.2645±0.1913 0.3023±0.0309DPNmodel group 12 1.0695± 0.18111） 0.1872±0.02971）Polygala treatment group 12 0.6266± 0.16332） 0.2464±0.04523）Polygala prevent group 12 0.3475± 0.10682） 0.2597±0.02163）

2.4 大鼠坐骨神经NFP表达的变化

NFP阳性产物为棕褐色颗粒，位于坐骨神经轴索（图1）。与正常对照组大鼠比较，DPN模型组大鼠坐骨神经NFP的表达明显降低（P＜0.01），远志治疗组和远志预防组大鼠坐骨神经NFP的表达明显高于DPN模型组（P＜0.05）。见表2。

图1 大鼠坐骨神经NFP表达×400Fig.1 NFPexpression on sciatic nerve of rats by immunohistochemistry×400

3 讨论

3.1 远志对DPN大鼠尾部SNCV的影响

长期的高血糖状态常可导致各种脏器，尤其是眼、肾、神经及心血管的慢性损害、功能不全和衰竭。DPN发病隐匿，主要临床表现为四肢远端（尤其是下肢）对称性感觉、运动障碍，已成为糖尿病致残、致死的主要原因之一。DPN可累及感觉神经、运动神经和自主神经，但以感觉神经最为常见［4］。在临床症状出现前，电生理检查就可发现神经传导速度减慢，特别是SNCV测定，可提示亚临床期的周围神经病变，是早期诊断DPN的敏感指标［5］。研究表明，DPN时周围神经轴索萎缩，可引起周围神经传导速度减慢［6］。本研究发现，DPN大鼠尾部SNCV明显降低，远志治疗组和远志预防组大鼠尾部SNCV明显高于DPN大鼠；表明远志治疗可明显加快DPN大鼠尾部SNCV，远志预处理可有效阻止DM大鼠尾部SNCV的减慢。

3.2 远志对DPN大鼠坐骨神经AR活性的影响

DPN的发病机制尚未完全明了，但已知并非单一因素所致。一般认为高血糖导致代谢异常是DPN发病的潜在启动与关键因素之一。多元醇代谢通路有两个关键酶，即AR和山梨醇脱氢酶，AR可催化葡萄糖转化成山梨醇，山梨醇脱氢酶催化山梨醇转化为果糖。DM时，长期高血糖状态可使葡萄糖多元醇代谢通路紊乱，导致AR活性增强，致使神经细胞内山梨醇、果糖大量积聚，继而引起神经细胞渗透压增高，Na+-K+-ATP酶活性下降，导致细胞肿胀、变性，生理功能受损，轴索萎缩，神经纤维节段性脱髓鞘［7］。另外，神经细胞内果糖的积聚可促进神经细胞骨架蛋白的糖化，干扰轴索的轴浆运输，引起神经结构和功能的改变［8］。本研究发现，DPN模型组大鼠坐骨神经AR活性明显增强，远志治疗组和远志预防组大鼠坐骨神经AR活性显著低于DPN大鼠，表明远志治疗可明显降低DPN大鼠坐骨神经AR活性，远志预处理可明显阻止DM大鼠坐骨神经AR活性的升高。

3.3 远志对DPN大鼠坐骨神经NFP表达的影响

细胞骨架（cytoskeleton）是细胞质内的非膜性细胞器，由微管、中间丝和微丝等组成。NFP为神经元中间丝的主要成分，除形成细胞骨架起支持作用，还与微管、微丝一起参与细胞内的物质运输。DM时NFP的表达可下降26%～46%，并伴有神经纤维中NFP数量减少和密度降低［9］。NFP表达的减少可导致神经元的合成、迁移和细胞内物质转运过程出现障碍，因此无法维持神经系统正常的功能活动［10］。Zochodne等［11］研究表明，NFP可以延缓DM时高血糖对小鼠坐骨神经轴索的损害。本研究发现，DPN模型组大鼠坐骨神经NFP的表达明显下降，远志治疗组和远志预防组大鼠坐骨神经NFP的表达高于DPN大鼠，表明远志治疗可明显升高DPN大鼠坐骨神经NFP的表达，远志预处理可明显阻止DM大鼠坐骨神经NFP表达的下降。

综上所述，远志显著改善DPN大鼠尾部SNCV，并通过降低坐骨神经AR活性，上调坐骨神经NFP表达，对DPN大鼠坐骨神经具有良好的保护作用；远志预处理可显著延缓DM时大鼠坐骨神经损伤。但相关作用机制不十分明确，尚有待进一步研究。

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（编辑 武玉欣，英文编辑 赵传胜）

Protective Effects of Polygala on Sciatic Nerve of Diabetic Peripheral Neuropathy Rats

MAHong-wei，FUXiu-mei，FUWen-liang，HEYa-qiang，CHENZhi-hong，XUEJing-feng
（Department of Human Anatomy，Chengde Medical College，Hebei Chengde 067000，China）

ObjectiveTo investigate the protective effects of Polygala on sciatic nerve of diabetic peripheral neuropathy（DPN）rats.MethodsMale Wistar rats were randomly divided into 4groups（n=12）：normal control group，DPNmodel group，Polygala treatment group and Polygala prevention group.The rats in DPNmodel group，Polygala treatment group and Polygala prevention group were made diabetes model by injecting streptozocin intraperitoneally.After the diabetes model was established，the rats in Polygala prevention group were lavaged with Polygala（2.7g·kg-1·d-1）for six weeks.The rats in DPNmodel group and Polygala treatment group were made DPNmodel when their caudal sense nerve conduction velocity （SNCV）was less than 30m/s；then the rats in Polygala treatment group were lavaged with Polygala（2.7g·kg-1·d-1）for six weeks.The caudal SNCVof rats in each group were respectively detected；Aldose reductase （AR）activity was detected by ultraviolet spectrophotometry and immunohistochemical staining was used to observe the expression of neurofilament protein（NFP）in sciatic nerve.ResultsCompared with normal rats，the caudal SNCVof DPNmodel rats decreased obviously，ARactivity of sciatic nerve increased markedly and NFPexpression decreased obviously （P<0.01）.Compared with DPNmodel rats，the caudal SNCVof rats in Polygala treatment group and Polygala prevention group obviously increased，ARactivity of sciatic nerve decreased markedly and NFPexpression obviously （P<0.01，P<0.05）increased.ConclusionPolygala has protective effects on DPNrats sciatic nerve by improving caudal SNCV，decreasing ARactivity and up regulating NFPexpression in sciatic nerve；moreover，Polygala pretreatment has preventive effects on sciatic nerve injury of diabetes rats.

Polygala；diabetic peripheral neuropathy；sciatic nerve

R961

A

0258-4646（2010）12-1001-04

河北省教育厅基金资助项目（2008407,2009404）

马洪伟（1983-），男，助教，硕士.

薛景凤，E-mail：xjf@cdmc.edu.cn

2010-08-23