基底样乳腺癌与ERK信号传导通路关系的研究

李超，高婷，陈广泉，姚凡，葛丹梅，金锋

（1.中国医科大学 附属第一医院乳腺外科，沈阳 110001；2.中国医科大学 附属第一医院肿瘤研究所第二研究室，沈阳 110001；3.沈阳市第四人民医院 普通外科，沈阳 110031；4.中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳 110001）

基底样乳腺癌与ERK信号传导通路关系的研究

李超1，高婷2，陈广泉3，姚凡1，葛丹梅4，金锋1

（1.中国医科大学 附属第一医院乳腺外科，沈阳 110001；2.中国医科大学 附属第一医院肿瘤研究所第二研究室，沈阳 110001；3.沈阳市第四人民医院 普通外科，沈阳 110031；4.中国医科大学附属第一医院肾内科，沈阳 110001）

目的 检测三阴性乳腺癌中CK5/6，EGFR，P-ERK的表达，探讨基底细胞样乳腺癌与ERK/MAPK信号传导通路的关系。方法 采用免疫组化法检测CK5/6，EGFR，P-ERK在70例三阴性乳腺癌组织中的表达。结果 在（70例）三阴性乳腺癌中，CK5/6与EGFR的阳性表达率分别为68.6%（48/70），57.1%（40/70），共筛出基底细胞样乳腺癌53例。在三阴性乳腺癌中P-ERK在基底细胞样乳腺癌与非基底细胞样乳腺癌的阳性表达率分别为79.2%（42/53），47.1%（8/17），其差异有统计学意义（P<0.05）。CK5/6与EGFR、P-ERK在基底细胞样乳腺癌的表达中具有正相关性（r=0.471；0.389，P<0.05）。结论 CK5/6，EGFR是诊断基底细胞样乳腺癌的重要分子标记物；基底细胞样乳腺癌的发生发展与ERK/MAPK信号传导通路被异常激活有关；CK5/6与EGFR、P-ERK在基底细胞样乳腺癌的表达中具有相关性。

基底细胞样乳腺癌；免疫组化；CK5/6；EGFR；P-ERK

近年来，基底细胞样型乳腺癌（basal-like breast carcinoma，BLBC）被广泛研究，其因具有更短生存期和更突出的临床病理特点而被看作独立的临床病种。这部分乳腺癌常表现为雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、原癌基因人类表皮生长因子受体2（human epiderl growth factor receptor-2，HER2） 均阴性，且CK5/6和（或）EGFR表达阳性［1，2］。但基底细胞样乳腺癌与三阴性乳腺癌（triple negative breast carcinoma，TNBC）并不完全相同［3～5］，根据基因表达谱分析，TNBC不仅包括基底细胞样亚型，还包括正常乳腺样型［6］，即TNBC中不表达CK5/6与EGFR的亚型（TN3BKE-）。有文献报道该亚型对于新辅助化疗敏感性不及BLBC，但预后较BLBC好［7～9］。

P-ERK（phospho-ERK），即磷酸化细胞外信号调节激酶，是ERK的活化形式。ERK信号途径可被许多生长因子、细胞素及激素和介导有丝分裂、分化的信号所激活，发生磷酸化而活化，进而调节细胞周期并促进细胞增殖、分化，并能抵制细胞调亡。因此，ERK信号转导途经的异常与肿瘤的发生发展密切相关［12］。本研究通过检测BLBC与TN3BKE-中PERK的表达情况，探讨BLBC与ERK/MAPK信号传导通路的关系，意在进一步明确ERK途径在BLBC发生发展及转移中的意义，并为该亚型乳腺癌患者的预后提供有益的参考指标。

1 材料与方法

1.1 材料

收集中国医科大学附属第一医院乳腺外科2006年1月至2009年12月存档并且免疫组化检测ER、PR及HER2均阴性的乳腺癌（即三阴性乳腺癌）病例70例，以上病例均由本院及同等级别医院病理医师对全部切片进行复查确诊。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化：每例切片厚4μm，置于涂有蛋白胶的玻片上。用PV9000二步法进行免疫组化染色。选用以下单克隆抗体：ER、PR、HER2、PV9000试剂盒及DAB均购自北京中杉金桥生物开发有限公司。CK5/6、EGFR购自Abcam公司。P-ERK购自Santa公司。

1.2.2 阳性判定：实验结果由两位经验丰富的病理医师判定。阳性物质为棕黄色，CK5/6、ERFR阳性物质分别位于胞膜、胞质内［11］，P-ERK位于细胞核［12］，ER、PR位于细胞核，HER2位于细胞膜。阳性细胞数<5%为阴性，5%～25%为（+），26%～50%为（++），>50%为（+++）；ER按Allerd评分法；HER2按美国临床肿瘤协会乳腺癌HER2检验指南判定。在数据分析时，将（+～+++）均归为阳性组判断。

1.2.3 统计分析：采用SPSS13.0软件，采用χ2检验进行统计学分析。应用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 BLBC、TN3BKE-的筛出

BLBC诊断标准：ER、PR、HER2均为阴性，且CK5/6和（或）EGFR表达阳性［1，2］。

TN3BKE-诊 断 标 准 ：ER、PR、HER2、CK5/6、EGFR均为阴性［9］。

按上述诊断标准在70例三阴性乳腺癌中共筛出BLBC53例，TN3BKE-17例。

2.2 CK5/6，EGFR在TNBC及BLBC中的表达

CK5/6在胞膜中表达（图1A），在TNBC中阳性表达48例，阳性率为68.6%（48/70）；EGFR在胞浆中表达（图1C），在TNBC中阳性表达40例，阳性率为57.1%（40/70）。筛出BLBC53例，其中CK5/6，EGFR在BLBC中阳性率分别为90.6%（48/53），75.5%（40/53）。

2.3 P-ERK在BLBC与TN3BKE-中的表达

本实验显示，P-ERK在胞核中表达（图1B），在BLBC中阳性表达42例，阳性率为79.2%（42/53）,而在TN3BKE-中阳性表达8例，阳性率为47.1%（8/17），其差异有显著意义（χ2=5.05，P<0.05）。

2.4 CK5/6、EGFR和P-ERK相关性分析

Spearman等级相关分析（表1）。

表1 CK5/6、EGFR和P-ERK相关性分析Tab.1 The correlate analysis between CK5/6，EGFRand P-ERK

图1 CK5/6、EGFR及P-ERK在三阴性乳腺癌中的表达Fig.1 Expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin triple negative carcinoma

3 讨论

基底细胞样乳腺癌是指具有基底细胞基因表型并不同程度的表达基底细胞角蛋白和肌上皮标志物的一种特殊类型的乳腺癌。Sorlie等［7］对多组基因芯片数据进行比较，将乳腺癌分为5种亚型，即管腔A型（luminal subtype A），管腔 B型（luminal subtype B）、正常乳腺样型 （normal breast-like subtype）、HER2过表达型（HER2over-expression subtype）及基底细胞样型（basal-like subtype）。BLBC约占全部乳腺癌的10%～20%，占高级别乳腺癌的25%。BLBC的临床行为具有较高的增殖活性和高度的侵袭性。BLBC的转移方式与其他乳腺癌也不尽相同，它们较少转移到腋窝淋巴结和骨，而更倾向于通过血道转移至脑和肺［13］。

目前，大多数学者认为CK5/6是确定BLBC最有效的标记物，本研究BLBC中CK5/6阳性率为90.6%，敏感性较高，因此CK5/6是诊断BLBC有价值的标记物。EGFR作为一种上皮生长因子受体，可能与细胞内信号激酶有关，特别是有丝分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT），他们与细胞增殖加速和细胞生存期延长密切相关，从而促进乳腺肿瘤的形成及发展，BLBC中EGFR高表达与其预后较差密切相关［14］。本研究BLBC中EGFR阳性率为75.5%，且均为强阳性表达，提示EGFR在BLBC的肿瘤发生发展中可能起重要作用。

ERK相关的细胞内信号传导通路被认为是经典的MAPK信号传导途径。现已证明多种细胞外信号通过不同的细胞内信号分子和信号通路活化ERK，传统的ERK活化模式可简单的概括为：各种生长因子、激素等→受体→Ras→Raf→MEK→ERK。Ras/Raf/MEK/ERK细胞信号传递通路是由一个小GTP蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白组成的级联反应。ERK异常活化导致细胞分化、凋亡功能的丧失，引起细胞恶性转化、异常增殖、肿瘤发生、侵袭能力增强，ERK被磷酸化后，其活性增强100倍以上，最终导致肿瘤转移。

有研究表明，非磷酸化的ERK在胞浆中与其上游的激活物MEK形成复合物，当ERK/MAPK通路被激活时，复合物解离，ERK被磷酸化而转入核内。本研究显示，P-ERK阳性信号位于细胞核内，在基底细胞样乳腺癌中P-ERK的阳性率为79.2%，在非基底细胞乳腺癌中P-ERK的阳性率为47.1%，其差异有显著意义（P<0.05）。说明基底细胞样乳腺癌与ERK/MAPK信号传导通路之间确有关系，表明ERK途径的过度激活在基底细胞样乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。

本研究显示CK5/6与EGFR有互相接近的阳性表达率，经统计学处理发现两者之间有正相关关系。此外本研究还发现CK5/6与P-ERK在基底细胞样乳腺癌的表达中具有正相关性，进一步提示基底细胞样乳腺癌的发生发展与ERK/MAPK信号传导通路被异常激活有关。

目前，肿瘤的治疗愈趋个体化。然而，BLBC中ER、PR、HER2阴性表达，因此抗激素治疗及赫赛汀（Herceptin）治疗效果不佳。对于这类乳腺癌，唯一的治疗方案为系统性化疗，寻找新的治疗靶点尚在摸索阶段。希望本研究能够指导临床，对基底细胞样乳腺癌患者通过药物等干扰ERK/MAPK通路的激活，来阻断肿瘤细胞的增殖和侵袭。

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（编辑 孙宪民，英文编辑 赵传胜）

Relationship between Basal-like Breast Carcinoma and ERKSignal Transduction Pathway

LIChao1，GAOTing2，CHENGuang-quan3，YAOFan1，GEDan-mei4，JINFeng1
（1.Department of Breast Suregry，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001；2.The second laboratory，Cancer research Institutem The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001；3.Department of Generral Sugery，The Fourth Hospital of People，Shenyang 110031；4.Departmet of Nephrology，The First Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo detect the expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin triple negative breast carcinoma and to probe into the relationship between basal-like breast carcinoma and ERK/MAPKsignal transduction pathway.MethodsTo detect the expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin 70cases of triple negative breast carcinoma by using immunohistochemistry （IHC）.ResultsIn 70cases of triple negative carcinoma，the positive rates of CK5/6and EGFRwere 68.6%（48/70）and 57.1%（40/70）respectively，and a total of 53cases of basal-like breast carcinoma were screened out.In triple negative breast carcinoma，the positive rate of P-ERKin basal-like breast carcinoma and non-basal-like breast carcinoma were 79.2%（42/53）and 47.1%（8/17）respectively，their difference was of statistical significance（P<0.05）.There was a positive correlation among expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin basal-like breast carcinoma（r=0.471；0.389，P<0.05）.ConclusionCK5/6and EGFRcan be used as important molecular markers for diagnosing basal-like breast carcinoma；occurrence and development of basal-like breast carcinoma relates to aberrant activation of ERK/MAPKsignal transduction pathway；and there is a correlation among expression of CK5/6，EGFRand P-ERKin basal-like breast carcinoma.

basal-like breast carcinoma；inmunohistochemistry；CK5/6；EGFR；P-ERK

R737.9

A

0258-4646（2010）12-1067-03

李超（1984-），男，硕士研究生.

金锋，E-mail：jinfeng66cn@hotmail.com

2010-06-30