中药胃肠安丸中5种蒽醌类成分的定量分析

张静泽， 高文远*， 王 磊，2， 马超一

(1.天津大学药物科学与技术学院，天津300072;2.天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂，天津300380)

中药胃肠安丸是由木香、沉香、枳壳(麸炒)、檀香、大黄、厚朴(姜制)、朱砂、麝香、巴豆霜、大枣(去核)、川芎等十一味中药组成［1］，其中君药:木香、沉香、檀香;臣药:厚朴、枳壳、川芎;佐使药:大黄、巴豆霜、麝香、大枣、朱砂。此方对于治疗各种感染性、非感染性腹泻以及胃肠功能性障碍所造成的恶心、呕吐、腹胀、腹痛、腹泻等症状效果显著，并能改善胃肠功能;具有解痉、止泻等作用。2005版中国药典中只是以厚朴中的厚朴酚及和厚朴酚作为质量控制的指标，凌宁生等又对其中柚皮苷的含量进行了测定，通过测定10个批次胃肠安丸样品发现其中柚皮苷含量不少于4.38 mg/g［2］。胃肠安丸组方独特，止泻不留邪，具有通因通用的特点，临床用于治疗腹泻的效果显著，能够明显缓解现代医学中腹泻型肠易激综合症的各种症状;同时胃肠安丸方对于胃肠道功能具有双向调节的作用，药理实验结果证明胃肠安丸甲醇提取物能够使正常小鼠的小肠推进率增加，使新斯的明致泻小鼠的小肠推进率明显降低［3］。因此，对于便秘型肠易激综合症的患者也有一定的治疗作用。方中大黄的蒽醌类成分对小肠运动有明显的促进作用，而对于方中具有泻下活性的大黄中蒽醌类成分的含量尚无报道，由于中药胃肠安丸对胃肠道功能具有双向调节作用，因此本实验采用RP-HPLC法对于胃肠安丸中所含的大黄蒽醌进行含量测定，一方面能够为保证胃肠安丸用药的安全有效提供了重要的数据支持，另一方面也为深入探讨大黄作为佐使药在方中的作用奠定基础。

1 仪器与试剂

1.1 样品与试剂 胃肠安丸由天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂生产，批号为:WCAWD109002、D109004、D10909、D109010、D109020。对照品:芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚(含量测定用，中国药品生物制品检定所提供，批号:110756-200310、0757-200206、110756-200110、1107996-200310、1107580-200409)。乙腈、甲醇为色谱纯、冰醋酸、氯仿为分析纯(天津康科德医药化工有限公司)。

1.2 仪器 高效液相色谱仪(Waters2414型高效液相色谱仪;Waters2998紫外-可见检测器);微量分析天平(CP225D，Sartourius Co.);Kromasil色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);微量进样器(25 μL，Hamilton)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相:A:甲醇，B:0.5%醋酸水溶液，梯度洗脱:0～20 min，A为65% ～85%;柱温:35℃;流速:1 mL/min;检测波长:254 nm。理论塔板数:各对照品对应色谱峰理论塔板数不小于4 000。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得到芦荟大黄素60 μg/mL、大黄酸90 μg/mL、大黄素100 μg/mL、大黄酚140 μg/mL、大黄素甲醚30 μg/mL的对照品溶液，分别吸取各对照品溶液2 mL混合均匀定容至10 mL，作为混合对照品贮备液，备用。

2.3 供试品溶液的制备 精密称定胃肠安丸粉末约1.0 g，置50 mL具塞三角瓶中，加甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，滤过，精密量取续滤液20 mL，置于烧瓶中，挥去溶剂，加8%HCl溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，加少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使之溶解，转移至10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得，微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。另取处方药材(缺大黄阴性)按照上述方法制备阴性对照品溶液。

2.4 线性关系的考察 精密吸取混合对照品溶液4、8、12、16、20 μL 进样，按上述色谱条件测定，分别记录峰面积。以大黄5种蒽醌进样量(X)为横坐标，相应峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归，所得线性回归方程分别为:芦荟大黄素:Y=11 645X－22 533，r=0.999 8;大黄酸:Y=61 823X －18 028，r=0.999 9;大黄素:Y=82 864X+24 062，r=0.999 8;大黄酚:Y=11 911X －25 010，r=0.999 8;大黄素甲醚:Y=71 408X －5 671，r=0.999 9。

线性范围分别为:芦荟大黄素3.29～16.44 μg/mL;大黄酸9.08 ～45.40 μg/mL;大黄素 13.92～69.60 μg/mL;大黄酚14.60 ～73.00 μg/mL;大黄素甲醚2.91～14.55 μg/mL，在此范围内样品浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 按2.1项下色谱条件，取混合对照品溶液连续进样6次，每次20 μL，依法测定，记录分析样品中大黄蒽醌各组分峰面积值，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD值分别为0.72%、0.82%、0.72%、0.91%、1.03%(n=6)，结果表明该仪器精密度较好。

2.6 重复性试验 取同一批号的胃肠安丸样品按照供试品溶液的制备方法配制溶液，分别精密称取5份，按2.1项下色谱条件，依法测定，记录分析样品中大黄蒽醌各组分峰面积值，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD值分别为1.45%、0.81%、0.76%、1.33%、1.29%(n=5)，实验结果表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一批号的胃肠安丸样品按照供试品溶液的制备方法配制溶液，避光室温放置，在0、2、4、6、8、10、12 h 分别进样20 μL，按照2.1 项下色谱条件，依法测定，记录与混合对照品相对应的各峰峰面积，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚 RSD分别为 0.98%、0.87%、1.00%、0.85%、1.24%，所得结果的RSD值均小于2%，表明供试样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批胃肠安样品约1.0 g，共6份，分别置上述具塞三角瓶中，精密吸取一定量混合蒽醌对照品溶液，混合均匀，按照2.1项下色谱条件，依法测定，记录峰面积，计算回收率，结果见表1。

表1 胃肠安丸中5种蒽醌类化合物加样回收率试验Tab.1 The recovery test results of 5 kinds of anthraquinones in Weichang’an Pill

2.9 空白试验 除大黄外按处方量称取其他药味，按处方工艺制成不含大黄的制剂，制成缺大黄的阴性空白对照液，按照2.1项下色谱条件，依法测定，记录各峰峰面积。对照品、空白对照和供试品的HPLC图见图1，由此证明其他药材中的所含的成分在此检测条件下并不影响大黄蒽醌的测定。

2.10 样品测定 取5批胃肠安丸，按2.3项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，每批制备3份。精密吸取供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，进行测定，按照5种蒽醌的标准曲线分别计算，结果见表2。通过对5批胃肠安丸中蒽醌类成分进行检测，胃肠安丸中5种蒽醌的总量不少于为1.03 mg/g。

3 讨论

胃肠安丸由十一味中药组成，其君药中木香的主要活性成分木香烃内酯和去氢木香内酯具有松弛平滑肌和解痉的作用，能够明显抑制小鼠肠蠕动［4］;臣药厚朴中主要活性成分厚朴酚对豚鼠末段结肠的推进具有明显抑制作用，提示其具有止泻作用，为中药厚朴治疗下消化道疾病的药理学基础之一;小肠炭末推进实验也证明厚朴酚能明显抑制小肠炭末推进率，说明其对小鼠的小肠运动具有抑制作用;还能明显减少番泻叶与蓖麻油引起的小鼠湿粪增加，说明其对番泻叶引起的肠道蠕动与分泌增加有明显抑制作用，对蓖麻油水解成蓖麻酸后引起水和电解质转运发生改变的过分泌反应有抑制作用，认为是胃肠安发挥止泻作用的物质基础之一［5］。然而对于方中具有泻下活性的大黄中蒽醌类成分的含量尚无报道，由于胃肠安对于胃肠道功能具有双向调节作用，因此对于具有泻下活性的大黄蒽醌含量进行测定对于评价胃肠安丸的质量具有指导意义。

图1 胃肠安丸HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard solution(A)，Weichang’an Pill sample solution(B)and negative sample(C)A.混合对照品 B.胃肠安供试品 C.阴性样品

表2 不同批次样品中5种蒽醌的含量测定结果(n=3)Tab.2 Contents of 5 kinds of anthraquinones in different samples(n=3)

胃肠安丸药味多，所含化合物种类繁多，在选择流动相比例时，考察了乙腈－0.5%醋酸水溶液，甲醇－0.5%醋酸水溶液等度与梯度条件下样品分离效果，在乙腈作为流动相时，调整流动相比例很难在短时间内将芦荟大黄素和大黄酸的两个色谱峰分开。多数对于复方中大黄蒽醌HPLC测定的色谱条件是采用甲醇 －0.1%磷酸溶液(85∶15)［6］，然而在对胃肠安丸进行测定时等度条件下分离效果不理想，因此采用甲醇－0.5%醋酸水溶液梯度洗脱分离效果良好，而且分析时间短，测定能够在30 min内完成。试验结果表明，该方法能够简单、快速、准确的测定胃肠安丸中蒽醌类成分的含量。

［1］中国药典［S］.一部.2005:518.

［2］凌宁生，杨 瑾，律兆荣，等.HPLC法测定胃肠安丸中柚皮苷［J］.中草药，2005，36(12):1815-1816.

［3］Hu Jing，Gao Wenyuan，Ling Ningsheng，et al.Antidiarrhoeal and intestinal modulatory activities of Wei-Chang-An-Wan extract［J］.J Ethnopharmacol，2009，125:450-455.

［4］张国华，王贺玲.木香对胃肠运动作用的影响及机制研究［J］.中国现代实用医学杂志，2004，3(13):24-26.

［5］朱自平，张明发，沈雅琴，等.厚朴对消化系统的药理作用［J］.中国中药杂志，1997，22(11):686.

［6］魏 萍，黄旭腾.黄芍颗粒中5种蒽醌成分的HPLC测定［J］.中成药，2009，31(12):附1-3.