sRAGE胞外段—IgGFc融合蛋白对大鼠糖尿病肾病的作用

张 璟,莫桂玲,苏志坚,许 华,郑 青*

(1暨南大学药学院,广州 510632；2暨南大学生命与健康工程研究院)

晚期糖基化终末产物(AGEs)是糖尿病肾病(DN)发病机制中的一个重要因素,在糖尿病(DM)高糖环境下,体内 AGEs明显增加,与 DM慢性并发症的发生、发展有关。研究表明,AGEs形成和堆积与 DN有密切关系[1]。可溶性 AGEs受体(sRAGE)无胞内段部分,可与细胞膜上的 RAGE竞争性结合 AGEs,从而阻断 AGEs与 RAGE的相互作用,抑制由RAGE诱导的细胞信号传导途径,为防治 DM并发症提供了新的治疗途径[2]。IgG型免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质,将人 IgG的 Fc区与其他目的蛋白质结合形成融合蛋白,延长目的蛋白质的半衰期已有报道[3]。由于结构上的同源,Fc融合蛋白具有的体外药物代谢动力学特性与同类型的人IgG相当,因此,目前已有一些 Fc融合蛋白药物(如治疗类风湿性关节炎的药物)应用于临床。2008～2009年,我们观察了 sRAGE-IgGFc融合蛋白对 DM大鼠的肾脏保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型 清洁级雌性 SD大鼠 60只,体质量(180±25)g,由广东省实验动物中心提供。将其随机分为正常对照组、DN组、洛汀新组(1.5 mg/kg)、sRAGE-IgG Fc 4 mg/kg组(L组)、sRAGE-IgGFc 6 mg/kg组(M组)、sRAGE-IgG Fc 9 mg/kg组(H组)各 10只。洛汀新组为灌胃给药,其余各组腹腔注射给药,均 1次/d,共 4周。各组普通饮食饲养 1周后,在戊巴比妥钠麻醉下,摘除左肾。术后 1周对 DN组予以高糖、高脂饮食。

1.2 DM模型制备 高糖、高脂饮食 1个月后,DN组一次腹腔注射链脲佐菌素 30 mg/kg。正常对照组注射等量柠檬酸钠—柠檬酸缓冲液。1周后检测其非空腹血糖(FPG)及胰岛素(INS),FPG≥16.7 mmol/L伴胰岛素敏感性降低为 DM建模成功。DM建模成功后,DN组继续普通饮食 2个月。

1.3 检测方法 ①FPG、INS检测:采用美国 Lifescan稳步血糖仪和试纸条检测 FPG；放免法、北京原子高科核技术应用公司产免疫活性胰岛素放免试剂盒检测 INS。②血压、血脂检测:采用 RBP-1大鼠尾血压测定仪检测血压；酶法检测血脂。③肾脏生化指标检测:实验结束前 1 d,用代谢笼收集各组 24 h尿液,用免疫散浊法检测尿蛋白和尿肌酐。次日用戊巴比妥钠麻醉大鼠,从其心脏采血,检测血肌酐(Scr)、血尿素氮 (BUN)、尿体积 (Urine volume)、尿白蛋白排泄率(UAER),计算内生肌酐清除率(Ccr)。④肾组织病理学检测:处死大鼠取其右肾,用中性甲醛固定,乙醇逐级脱水,石蜡包埋切片,常规 HE染色,树胶固封；在光镜下(400×)观察各组肾组织变化。

1.4 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件,数据以±s表示,组间比较用 t检验。 P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组 FPG、INS比较 见表1。

表1 各组 FPG及 INS比较(±s)

表1 各组 FPG及 INS比较(±s)

注:与正常对照组比较,*P＜0.01

组别 n FPG(mmol/L) INS(mIU/L)正常对照组 10 5.73±0.30 20.80±1.32 DN组 10 30.38±3.36* 12.62±1.69*洛汀新组 10 29.24±3.21* 12.34±2.04*L组 10 30.80±3.07* 11.87±0.98*M组 10 30.19±3.08* 12.08±0.97*H组 10 29.96±3.31* 12.25±1.47*

2.2 各组血压、血脂比较 见表2。

表2 各组血压、血脂比较(±s)

表2 各组血压、血脂比较(±s)

注:与正常对照组比较,*P＜0.01；与 DN组比较,△P＜0.01

组别 n BP(kPa) TG(mmol/L)TC(mmol/L)正常对照组 10 13.37±1.21 0.73±0.12 1.19±0.13 DN组 10 21.18±1.90* 2.23±0.17*4.38±0.27*洛汀新组 10 16.76±1.36*△ 2.15±0.15*4.26±0.21*L组 10 19.25±1.40* 2.20±0.20*4.30±0.24*M组 10 17.92±1.27*△ 2.18±0.18*4.24±0.25*H组 10 17.28±1.34*△ 2.15±0.18*4.25±0.26*

2.3 各组肾脏生化指标比较 见表3。

表3 各组肾脏生化指标比较(±s)

表3 各组肾脏生化指标比较(±s)

注:与正常对照组比较,*P＜0.01；与DN组比较,△P＜0.01

组别 n BUN(mmol/L) Scr(μmol/L) Ccr(ml/min) Urine volume(ml) UAER(mg/24 h)正常对照组 10 6.91±0.45 60.59±6.66 0.65±0.07 25.12±2.37 3.25±0.47 DN组 10 18.42±1.06* 125.59±12.16* 1.70±0.11* 97.29±6.26* 12.53±2.43*洛汀新组 10 9.22±0.57 71.23±3.52△ 1.22±0.15△ 55.53±4.02*△ 7.37±1.11*△L组 10 12.59±0.62* 89.54±4.12△ 1.39±0.06△ 96.24±3.27 9.01±0.69*△M组 10 11.21±0.56* 79.49±4.13△ 1.31±0.17△ 91.52±1.17 8.13±0.62*△H组 10 9.22±0.35△ 70.89±5.31△ 1.22±0.14△ 93.47±2.29 7.39±0.69*△

2.4 各组光镜下肾脏病理变化 正常对照组肾组织无病理改变。DN组肾小球体积明显增大,细胞数量增多,可见炎细胞浸润；部分肾小球系膜细胞增生,毛细血管基底膜呈弥漫性增厚,系膜基质增宽；部分肾小管发生轻度萎缩或管腔扩张,上皮细胞水肿,空泡变性明显,间质可见炎性细胞浸润和纤维增生。洛汀新组、L组、M组、H组肾脏病变不同程度地减轻,部分肾小球增大、肾小球系膜细胞增生等减轻,以 H组作用明显。

3 讨论

近年来,sRAGE作为 RAGE拮抗剂是治疗 DN的一条新途径。正常情况下,血浆中存在微量sRAGE,长期给药不会引起人体免疫效应[4]。我们将 IgG的 Fc段接在 sRAGE后构建 sRAGE-IgG Fc融合蛋白,希望能延长其半衰期,并赋予其一定的靶向。本研究显示,与正常对照组比较,DN组血糖、血脂降低无统计学差异,可能与 sRAGE-IgGFc融合蛋白不能对胰岛形成显著的保护有关。DN组BUN、Scr、Ccr、UAER及血压均明显高于正常对照组,而给予 sRAGE-IgGFc融合蛋白的 L、M、H组上述指标均不同程度地降低,且光镜下可见肾小球增大及肾小球系膜细胞增生等改变减轻。其可能原因是在血管和肾组织中,sRAGE-IgG Fc融合蛋白与AGEs结合并阻止了 AGEs-RAGE的相互作用,从而起到肾脏保护作用。

[1]Raptis AE,Viberti G.Pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Exp Clin Endocr Diab,2001,109(2):424-437.

[2]Angeliga B,Per M,Humper T,et al.Understanding RAGE,the receptor for advanced glycation end products[J].J Mol Med,2005,83(11):876-886.

[3]Capon DJ,Chamow SM,Mordenti J,et al.Designing CD4immunoadhesinsfor AIDS therapy[J].Nature,1989,337(6207):525-531.

[4]刘华.晚期糖基化终末产物及其受体与糖尿病肾病[J].国外医学:泌尿系统疾病分册,2005,25(4):658-660.