单硝酸异山梨酯注射液细菌内毒素检查法研究

吴 婷，李 薇

（广州市药品检验所，广东广州 510160）

单硝酸异山梨酯注射液 （Isosorbide Mononitrate Injection）为新一代的长效硝酸酯类抗心绞痛药物，通过扩张外周血管，特别是静脉容量血管，减少回心血量，降低心脏前后负荷，使心肌耗氧量减少，发挥抗心肌缺血作用[1-2]。主要用于冠心病的长期治疗，心绞痛的预防，心肌梗死后持续心绞痛的治疗；与洋地黄或利尿剂联合应用，治疗慢性充血性心力衰竭。单硝酸异山梨酯注射液具有较强的扩张冠状动脉作用，从而改善缺血性心脏病供血状况，它还具有抑制血小板聚集和降低血液黏附作用[3]。本品与其他血管扩张剂、钙拮抗剂、β受体阻滞剂、抗高血压压药、三环抗抑郁药及酒精合用，可强化本类药物的降血压效应。本品收载于国家药品标准WS1-（X-078）-2004Z，但未规定细菌内毒素检查标准。为了提高药品控制标准，现对单硝酸异山梨酯注射液进行了实验研究，建立了本品的细菌内毒素检查质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

旋涡振荡器（德国IKA，型号：MS-1）；四孔水浴锅（英国GRANT，型号：SUB14）。

1.2 试药

单硝酸异山梨酯注射液（a.批号：0601428，规格：5 ml∶20 mg，济南利民制药有限责任公司；b.批号：20050702，规格：5 ml∶20mg，山东海山药业有限公司；c.批号：060110，规格：2 ml∶25 mg，南宁枫叶药业有限公司；d.批号：040801，规格：2 ml∶25 mg，上海旭东海普药业有限公司；e.批号：070502，规格：5 ml∶20 mg，广东省博罗先锋药业集团有限公司）。鲎试剂（a.TAL，批号：0809091，规格：0.1 ml/支，标示灵敏度：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司鲎试剂；b.TAL，批号：081124，规格：0.1 ml/支，标示灵敏度：0.25 EU/ml，厦门市鲎试剂实验厂有限公司鲎试剂）。细菌内毒素工作标准品（CSE，批号：150601-200860，效价：160 EU/支，中国药品生物制品检定所）。内毒素检查用水（BET 水，批号：0801180，规格：50 ml，湛江安度斯生物有限公司）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定[4]

按《中国药典》2005年版二部中细菌内毒素检查法的规定，根据公式L=K/M，式中L为供试品的细菌内毒素限值，K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K=5 EU/（kg·h），M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按60 kg计算，注射时间若不足1 h，按1 h计算。

本品收载于国家药品标准WS1-（X-078）-2004Z，规格：5 ml∶20 mg、2 ml∶25 mg、2 ml∶20 mg、1 ml∶10 mg， 热原剂量为1 mg/kg。根据单硝酸异山梨酯注射液说明书的用法用量，静脉滴注一般有效剂量：每小时 2～7 mg，一般速度：60～120 μg/min，本品的 M=7 mg/（60 kg·1 h）=0.12 mg/（kg·h）。 K 为 5 EU/（kg·h），本品用于心血管药、儿童老人用药，根据《注射剂安全性检查法应用指导原则》（修订稿）的要求安全系数定为3，按公式L=K/M计算，则L=14 EU/mg。

2.2 鲎试剂灵敏度复核试验

按照《中国药典》2005年版二部附录ⅪE“鲎试剂灵敏度复核试验”项下进行，结果见表1。2批鲎试剂灵敏度分别为0.18、0.25 EU/ml，均在 0.50～2.00 范围内，灵敏度符合规定，可用于细菌内毒素检查。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验Tab.1 Sensitivity test of tachypleus amebocyte lysate

单硝酸异山梨酯注射液有效稀释浓度（MVC）的计算[5-6]根据公式MVC=λ/L，其中L为内毒素限值14 EU/mg，λ为鲎试剂标示灵敏度，目前市售鲎试剂灵敏度范围为0.50～0.03 EU/ml，则单硝酸异山梨酯注射液对应的有效稀释浓度分别为0.040 0、0.020 0、0.010 0、0.005 0、0.002 5 mg/ml。

2.3 干扰预试验[7]

用细菌内毒素检查用水将单硝酸异山梨酯注射液分别稀释至 0.040 0、0.020 0、0.010 0、0.005 0、0.002 5 mg/ml的浓度，将此系列稀释液记为NPC系列，同时在上述系列的试验液中加入2λ浓度的细菌内毒素标准溶液，记为PPC系列。取灵敏度为0.25 EU/ml的两个厂家的鲎试剂，分别与上述NPC、PPC系列进行反应，每一浓度重复两管，并设阳性和阴性对照。结果见表2、3。

表2 单硝酸异山梨酯注射液的干扰预试验1Tab.2 Results of prerliminary interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 1

表3 单硝酸异山梨酯注射液的干扰预试验2Tab.3 Results of prerliminary interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 2

由以上干扰预试验结果可以初步了解，两个厂家鲎试剂对单硝酸异山梨酯注射液的细菌内毒素的试验结果均在0.04 mg/ml以下浓度时无干扰。

2.4 干扰试验

为了最终确认无干扰因素，进行以下干扰试验。将单硝酸异山梨酯注射液用细菌内毒素检查用水进行稀释，使其最终浓度为0.02 mg/ml，按照《中国药典》2005年版二部附录中的“细菌内毒素检查供试频干扰试验”项下进行试验，结果见表 4、5。

表4 单硝酸异山梨酯注射液的干扰试验1Tab.4 Results of interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 1

表5 单硝酸异山梨酯注射液的干扰试验2Tab.5 Results of interference test of Isosorbide Mononitrate Injection 2

5批单硝酸异山梨酯注射液用两个厂家生产的鲎试剂进行试验，结果单硝酸异山梨酯注射液0.02 mg/ml稀释溶液对两个厂家生产的鲎试剂无干扰作用，Es/Et均在0.5～2.0范围内。

2.5 样品细菌内毒素检查

取9个厂家生产的22批单硝酸异山梨酯注射液，分别稀释到0.02 mg/ml，使用两个厂家的灵敏度均为0.25 EU/ml的鲎试剂，按照《中国药典》2005年版二部附录“细菌内毒素检查法”进行检查，结果全部符合规定。由此可得结论，单硝酸异山梨酯注射液稀释到0.02 mg/ml时对鲎试剂与内毒素凝集反应无干扰作用，可适用细菌内毒素检查法。

3 讨论

本品单硝酸异山梨酯注射液收载于国家药品标准WS1-（X-078）-2004Z，规格：5 ml∶20 mg、2 ml∶25 mg、2 ml∶20 mg、1 ml∶10 mg。现有的标准规定为热原检查，剂量为1 mg/kg。目前本品无细菌内毒素检查项标准，如采用鲎试剂法来控制细菌内毒素，操作简易且结果可靠。从干扰预试验和正式干扰试验可知，单硝酸异山梨酯注射液对鲎试剂无干扰的有效浓度范围在0.04 mg/ml以下，在此浓度范围内，可用灵敏度为0.25 EU/ml的鲎试剂进行检验。由于不同厂家生产的鲎试剂其抗干扰能力存在差异，所以本实验采用了两个厂家鲎试剂进行干扰试验。实验结果表明，单硝酸异山梨酯注射液稀释到0.02 mg/ml时对鲎试剂与内毒素凝集反应无干扰作用，可适用细菌内毒素检查法。因此，本品采用限值14 EU/mg进行细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的。

[1]王茹.静脉滴注单硝酸异山梨酯注射液治疗冠心病心绞痛的临床观察与护理[J].临床医药实践杂志,2008,39(2):140.

[2]方巧云,江晓风.静滴鲁南欣康治疗高血压急症的临床观察与护理[J].临床护理杂志,2005,6(4):65-66.

[3]宋文宣,张七一,孙王安,等.实用心血管病药学[M].北京:人民卫生出版社,2001:553-554.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005:Ⅺ E.

[5]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社,2005:287-297.

[6]潘正兴,宋勤.注射用奥美拉唑钠细菌内毒素检查法[J].药物分析杂志,2008,28(2):275-277.

[7]王慧明,陈邦树.胞磷胆碱钠注射液细菌内毒素检查法[J].中国药师,2005,8(9):793.