洋铁酸模提取物体外抑真菌作用活性部位筛选研究

孙全乐,蔡广知,殷 丹,沈晓君,贡济宇

(长春中医药大学,吉林长春130117)

中药洋铁酸模作为一种古老的中草药,在民间应用已有上千年的历史,临床应用该药治疗皮肤疾患和止血,疗效确切。洋铁酸模在我省广泛分布,资源丰富。开发潜力巨大,应用前景广阔。因此,本试验对洋铁酸模的抑菌活性进行研究,以白色念珠菌、红毛癣菌为例,旨在为其药用提供理论依据与技术支持,以期充分开发利用我省的该种药用资源。

1 材料与仪器

1.1 材料 实验用洋铁酸模药材均于2007年采于吉林省,经长春中医药大学药用植物教研室张雅芝教授鉴定为洋铁酸模(Rumex patlent L.var.eallosus F.Sehm.etMaxim)。两种真菌即红毛癣菌(Trichophyton rubrum)20株、白色念珠菌(Candida allbicans)16株,均由吉林大学基础医学院病原微生物教研室真菌菌种保藏中心提供。实验前均经活化接种。

1.2 仪器与设备 C52型医用超净工作台、DHG-9132A型电热恒温培养箱、DHS型隔水式电热恒温培养箱;YXQ.SG41.80型高压蒸汽灭菌锅、HH.SI1-2型电热恒温水浴锅、R51型旋转蒸发器。

2 实验方法

2.1 供试菌的准备 将白色念珠菌、红毛癣菌分别接入斜面培养基中,28℃培养72 h。再移种至沙氏培养基中,在28℃培养24 h,取出备用。

2.2 平板的制备 配制好培养基,沙氏培养基(蛋白胨10 g,葡萄糖40g,琼脂15 g,加入无菌水1000 mL,搅拌加热煮沸至完全溶解)经高压蒸汽消毒灭菌后,冷却至50℃左右,无菌操作下倒入干热灭菌好的培养皿内,每皿约15～20 mL,即培养皿内培养基的厚度约2～2.5 mm,准备够充足数量。

2.3 样品溶液的制备 洋铁酸模药材分别以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取、水提取,精密称取 4种提取物分别将各部位以DMF(N,N二甲基甲酰胺)为溶剂均配制成10 g生药/mL,分别于115℃,高压灭菌30 min备用。

2.4 供试菌菌悬液的制备 将测试菌于25℃环境下活化,用接种环挑取少许菌加入生理盐水充分振荡,制备菌悬液,采用麦氏比浊法调菌悬液浓度达0.5 Mcfarland单位,即含1.5×107～108cfu/mL,稀释10倍,备用。

2.5 抑菌滤纸片的制备 使用内径为6 mm的打孔器在定性滤纸上均匀打孔,将滤纸片装入50 mL的三角锥形瓶中,塞上棉塞,121℃高压灭菌20 min后冷却备用。在医用型超净工作台中,分别将相应数量的无菌滤纸片浸泡在装有供试液相应锥形瓶中,浸泡3 h后作为抑菌滤纸片备用。

2.6 抑菌试验 在无菌条件下用微量移液器吸取菌悬液100 μ L,滴在平板培养基上,用涂布器涂匀。分别将4种提取物抑菌滤纸片以三点法放在涂有菌液的培养基上,重复做3次,做好标记;另外同时将4种提取物放于同一培养皿中,重复做3次,做好标记,将抑菌平皿倒置于恒温培养箱中。另设对照组,对照组分别加入DMF,28℃培养72 h后,取出测定抑菌圈直径大小,根据抑菌圈大小计算出抑菌率[1-2]。

2.7 统计学方法 利用SPSS 13.0软件进行统计学处理[2],各组总体均数用单因素方差分析比较(ANOVA),分别比较洋铁酸模的4种提取物于同一皿中的抑菌效果,采用 t检验。

2.8 最小抑菌浓度的确定 采用连续稀释法[3-4]。在灭菌的培养管中加入2 mL经灭菌的液体沙氏培养基,用微量移液器吸取洋铁酸模提取物原液,使洋铁酸模提取物浓度倍比稀释为120,60,30,15,7.5 mg/mL系列浓度,各加入20 μ L 菌悬液,于28℃培养72 h后,以未接种的培养液加空白溶剂为对照,测定乙酸乙酯提取物对36株临床常见皮肤癣菌的最小抑菌浓度(MIC)值。

2.9 温度对提取物抑菌活性的影响 洋铁酸模乙酸乙酯提取物分别经40,60,80℃处理2 h后,检测其抑菌活性。

3 结果与分析

3.1 洋铁酸模提取物对真菌的抑菌效果 见表1,表2。

表1 洋铁酸模提取物对真菌红毛癣菌抑菌效果 mm

表2 洋铁酸模提取物对真菌白色念珠菌抑菌效果 mm

3.2 洋铁酸模提取物对真菌的抑菌率 见表3。

表3 洋铁酸模提取物对真菌的抑菌率

3.3 温度对乙醇乙酯提取物抑菌活性的影响 见表4。

表4 温度对乙酸乙酯提取物抑菌活性的影响

3.4 最小抑菌浓度 见表5。

表5 乙酸乙酯提取物对真菌的最小抑菌浓度

4 讨论

4.1 洋铁酸模的4种粗提液与对照组比较,洋铁酸模石油醚提取物、洋铁酸模乙酸乙酯提取物、洋铁酸模正丁醇提取物、洋铁酸模水提物的抑菌效果均强于对照组。

4.2 洋铁酸模的4个部位比较,其中乙酸乙酯部位、对红毛癣菌的生长均有一定的抑制作用,而正丁醇部位抑菌作用不理想,其他两个部位无明显作用。

4.3 洋铁酸模2个部位对红毛癣菌的生长有较明显的抑制作用,而对白色念珠菌的抑制作用很弱。

4.4 洋铁酸模乙酸乙酯提取物对红毛癣菌的最小抑菌浓度为30 mg/mL;而对白色念珠菌的最小抑菌浓度为120 mg/mL。

4.5 该提取物的抑菌成分在40,60℃下(处理2 h)较稳定,但在80℃以上温度时,稳定性较差。

本实验研究结果验证了洋铁酸模可抑制真菌生长,同时筛选出的活性部位为乙酸乙酯层。笔者认为乙酸乙酯提取物的主要成分尚待进一步分离、鉴定。如能进一步分离具体的抑菌成分,有望开发洋铁酸模相关抑菌产品[5-6]。

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