HPLC检测蜜炙甘草中主要成分含量的研究

伏秦超,王 钢,赵 乐

(1.乐山师范学院峨眉山生物多样性保护与利用研究所,四川乐山614004;2.乐山市人民医院药剂科,四川乐山6140004)

炙甘草(Radix Glycyrrhizae Preparata)是由生甘草加黄酒和蜜炮制得到的,具有多种药理作用的中药。生甘草补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药;蜜炙甘草补脾和胃,益气复脉[1]。甘草中发挥药理作用的主要成分为异甘草素、甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸等活性成分[2]。但目前关于蜜炙甘草和生用甘草中主要成分含量检测的研究鲜见报道。本实验采用高效液相色谱法,分别对蜜炙甘草和生用甘草中各主要药理活性成分含量进行检测,以探究蜜炙与生用甘草药理作用差异性的物质基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津)配紫外检测器;色谱柱:Shim-pack VP 18(150 mm×4.6 mm,5 μ m);FC204型电子分析天平(上海精科天平);KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 生甘草为药用饮片购自乐山市中药材公司;蜜炙甘草按尹燕侠等[3]方法制备;98%异甘草素(批号:080921)、98%甘草苷(批号:081026)、99%甘草酸单铵盐(批号:090317)、99%甘草次酸(批号:090319),均购自上海融禾医药科技发展有限公司;乙醇、冰醋酸、醋酸铵、磷酸、浓盐酸、氯仿等均为国产分析纯,乙腈、甲醇为国产HPLC色谱纯,所有化试药物均0.22 μ m滤膜过滤;水为自制重蒸水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制 将异甘草素、甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸分别按表1所述进行标准溶液的配制。

表1 标准溶液的配制 g/L

2.2 待检溶液的制备 异甘草素和甘草苷:称取生甘草和蜜炙甘草各0.02 g,分别溶于10 mL 50%乙醇中,80℃水浴20 min,超声提取 10 min,过滤,滤液经0.22 μ m微孔滤膜过滤,即得异甘草素、甘草苷待检溶液。甘草酸单铵:称取生甘草和蜜炙甘草各0.5 g,分别置于不同三角瓶中,加入40 mL蒸馏水,煮沸,再沸水浴 20 min,超声提取 10 min,过滤 ,滤液经 0.22 μ m微孔滤膜过滤,即得甘草酸单铵待检溶液。甘草次酸:称取生甘草和蜜炙甘草各0.2 g,分别置于不同三角瓶中,加入浓盐酸5 mL,再加入氯仿20 mL,超声提取2次,每次10 min,合并氯仿液,过滤。滤液蒸干,加入10 mL甲醇溶解,经 0.22 μ m微孔滤膜过滤,即得甘草次酸待检溶液。

2.3 色谱条件 通过试验,确定高效液相色谱检测仪的最佳工作条件,具体的参数如表2所示。异甘草素、甘草苷、甘草酸单铵盐、甘草次酸色谱图分别见图1～图4。

2.3.1 异甘草素 图1所示依次为异甘草素标准品、待检溶液检测结果。

图1 异甘草素标准品、样品HPLC图

2.3.2 甘草苷 图2所示依次为甘草苷标准品、待检溶液检测结果。

图2 甘草苷标准品、样品HPLC图

2.3.3 甘草酸单铵盐 图3所示依次为甘草酸单铵盐标准品、待检溶液检测结果。

图3 甘草酸单铵盐标准品、样品HPLC图

2.3.4 甘草次酸 图4所示依次为甘草次酸标准品、待检溶液检测结果。

图4 甘草次酸标准品、样品HPLC图

表2 仪器工作条件

2.4 方法的专属性考察 在上述的色谱条件下,将对照品溶液、供试品溶液、甘草阴性对照溶液注入液相色谱仪中,得HPLC图(以异甘草素为例,结果见图5),结果显示阴性对照无干扰。

图5 对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液HPLC图

2.5 线性关系考察 通过对平均峰面积Y对进样量X进行线性回归,分别列出了各主要成分含量的线性方程。结果见表3。

表3 回归方程 μ g

2.6 样品测定 将2.2项下待检溶液进行测定并计算各成分的含量,结果显示,蜜炙对甘草中甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸的含量影响极显著,见表4。

2.7 精密度试验 精密移取对照品10.0 μ L,连续进样5次,测定峰面积,得异甘草素、甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸峰面积的 RSD分别为1.02%、0.96%、1.05%和1.10%。

2.8 重现性试验 精密称取同一样品5份,依法测定。结果显示:异甘草素、甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸的平均含量分别为 0.0239%、0.2756%、1.6477%和2.3479%,RSD分别为1.10%、1.04%、1.01%和1.06%。表明重现性良好。

2.9 回收率试验 按2.2项制备样品溶液的方法精密称取适量的已测知含量的任一样品各5份,制备不同的样品溶液,分别加入已知量的相应的对照品溶液。按照2.3项下的色谱条件测定。计算异甘草素、甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸的回收率。结果显示异甘草素、甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸的平均回收率分别为98.0%、98.8%、98.9%和99.6%。结果见表5。

表4 蜜炙甘草中各成分含量测定结果(±s,n=3) %

表4 蜜炙甘草中各成分含量测定结果(±s,n=3) %

注:与生甘草比较,##P＜0.01。

组 别 异甘草素 甘草苷 甘草酸单铵盐 甘草次酸生 甘 草 0.0251±0.0003 0.4105±0.0041 2.0981±0.0227 3.8862±0.0378蜜炙甘草 0.0237±0.0001 0.2776±0.0024## 1.6355±0.0157## 2.3342±0.0223##

表5 加样回收率试验结果(n=5)

3 讨论

3.1 甘草入药已有悠久历史,早在二千多年前,《神农本草经》就将其列为药之上乘。南朝医学家陶弘景将甘草尊为“国老”[4]。甘草性平味甘,生则微寒,能清热解毒,润肺祛痰;炙则微温,能益气生津,缓和药性,缓急定痛。甘草配伍药方临床上被用于慢性胃炎[5]、慢性腰肌劳损[6]、慢性咽痛和夜尿频多[7]的治疗。现代医药研究证明,甘草中的异甘草素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用[8],甘草苷具有抗抑郁作用[9],甘草酸和甘草次酸具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、降血脂、防治肿瘤、促进胰岛素吸收等多方面作用[10]。但是,临床上大量使用生甘草时常伴有类醛固酮增多症,其特征是钠潴留、钾排泄量增加,引起水肿、高血压、低血钾等一系列的副作用[11]。从本实验数据统计分析显示:在同样的处理条件下,与生甘草相比,蜜炙甘草中甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸的含量降低了28.2%、17.2%和36.2%,异甘草素含量几乎无差异。因此,从上可推导出,蜜炙甘草较生甘草功能发生改变的主要原因是甘草苷、甘草酸单铵盐和甘草次酸等主要成分的含量变化所致。

3.2 蜜炙甘草是经蜜、酒和水浸润后文火炒至六、七成干而炙成的,其中加蜜的目的是除去杂质、部分水分和杀灭微生物,加酒有助于蜜的渗透作用和有效成分的溶出。从以上实验结果分析,由于异甘草素和甘草次酸是脂溶性物质,故水煎很难溶出。因此,该类脂溶性药物的药理作用活性和蜜炙甘草中加蜜和酒的作用还有待考究。

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[4]王荣.甘草——药王国里的“国老”[J].开卷有益:求医问药,2009(6):32-33.

[5]邢晓娟.半夏泻心汤合芍药甘草汤治疗慢性胃炎[J].吉林中医药,2006,26(3):30

[6]唐欣荣,任东坡,申艳慧,等.加味芍药甘草汤治疗慢性腰肌劳损临床观察[J].吉林中医药,2009,29(2):134-135.

[7]李权英.甘草干姜汤治验举隅[J].长春中医药大学学报,2009,25(3):359.

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