RNA干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用

何 文, 吴蓓蕾, 李 莉, 王锡锋

(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

水稻病毒病是由病毒引起的一类系统性侵染病害,世界上已经发现和确认的水稻病毒病(包括类菌原体病)约有16种,其中在我国发生的有11种(包括两种类菌原体病),分别是普通矮缩病、黄叶病、条纹叶枯病、黑条矮缩病、黄萎病、草状矮缩病、簇矮病、锯齿叶矮缩病、橙叶病、东格鲁病、瘤矮病。中国稻区广阔,水稻病毒病可广泛流行,在病害严重流行时,曾十几个省相继发病,暴发成灾,仅一个省(市、自治区)因病损失稻谷即数十万t。北方粳稻产区以水稻条纹叶枯病发生普遍。

水稻条纹叶枯病(ricestripedisease)是由水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)引起的一种最严重的水稻病毒病害,是通过灰飞虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]刺吸以持久性方式传播,汁液、土壤及种子均不能传毒。自20世纪80年代末期以来,该病在我国水稻种植区的发病率逐年提高,特别是在粳稻种植区,发生更为普遍。据不完全统计,全国近年该病的发病面积已达267万hm2以上,病区发病率一般在10%～20%,重者株发病率达50%～80%,给农民带来重大经济损失[1]。

利用水稻品种抗性被认为是防治水稻条纹叶枯病最经济、有效的方法。用常规方法培育抗病品种存在育种周期长、效率低,抗病基因与不良性状连锁等问题。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术所具有的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变基因组的遗传组成等特性,为基因功能的研究提供了强有力的手段,同时也为转基因植物抗病毒病害增添了新的策略和方法。

1 RNA干扰(RNAi)

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子引起的序列特异性靶基因mRNA降解,从而导致内源或外源靶基因沉默的机制。

1.1 RNAi的发现

尽管RNAi现象只是在20世纪90年代以来才被认识并逐渐引起人们的注意,但是第1篇与RNAi相关的文章可能早在 1928年就已发表。Wingard[2]发现由烟草环斑病毒侵染的烟草植株开始时表现出明显的病症,但上部叶片的症状会逐渐变轻,可以从病毒侵染症状中“恢复”过来,并且新长出的叶片可抵抗同源病毒的再次侵染,具有了一定的抗性。当时并没有有关RNAi机制的任何信息,甚至不知道烟草环斑病毒的基因组是RNA。不过,这一现象说明了抗性机制的存在可以限制或阻止病毒的再次侵染。1998年,Fire等人[3]将dsRNA注入线虫(Caenorhabditiselegans)体内后发现可抑制序列同源基因的表达,抑制主要作用于转录之后,并将此现象称为RNA干扰。此后,RNA干扰现象被证明广泛存在于真菌、线虫、果蝇、植物、高等动物等生物中,发现者也因此获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。

1.2 RNAi的作用机制

1.2.1 dsRNA的来源

经研究发现有多种途径可以产生dsRNA,主要为：1)当基因组的一些随机位点被插入一段序列的多个拷贝时,侧翼启动子驱动转录,转录通读可以产生与该正义链序列互补的双链RNA,形成dsRNA;2)对于具有末端反向重复序列的转座子,转录通读产生的RNA会自身回折形成发夹结构的dsRNA(hairpinRNA,hpRNA)[4-5];3)帮助细胞识别异常的 RNA(aberrantRNA),并在 RdRP(RNA-dependentRNApolymerase)作用下,转变成dsRNA[6];4)植物中,RNA病毒感染可以直接引入dsRNA[4-5];5)外源基因以反向重复的形式插入基因组后可转录产生hpRNA;6)正义RNA大量表达引起的共抑制,也能诱导dsRNA的产生[7];7)病毒或植物细胞中的miRNA基因,其前体miRNA(premiRNA)被 DCL1加工为 miRNA-miRNA*双体(即为dsRNA)[8-9]。无论哪种途径产生的dsRNA,都可引发RNAi。

1.2.2 RdRp介导的补充途径

在线虫、植物、真菌和果蝇中还存在依赖RNA的RNA聚合酶介导的补充途径,RdRp可能的作用方式有：1)RdRP以siRNA单链为引物合成靶mRNA的互补链;2)不需要引物直接合成异常RNA的互补链;3)在1条mRNA链上结合了2条或多条siRNA引物,分别由RdRP延伸后再由RNA连接酶连接成互补链;4)dsRNA解旋后,2条链均结合上siRNA引物,分别由 RdRP合成互补链,新合成的次生dsRNA又被Dicer切割成大量次生siRNA,从而增强了诱导基因沉默的效率[6]。

1.2.3 RNAi的3种主要途径

通过大量基因抑制现象的研究,以及生化和遗传学上的分析表明,基因沉默有3种不同的途径。这3种途径都包括dsRNA被含有RNaseIII结构域的Dicer酶切割为21～26个核苷酸小分子RNA的过程[10]。目前研究比较清楚且使用较多的基因沉默小分子RNA主要有siRNA(smallinterfering RNA)及miRNA(microRNA)。

图1 RNA干扰的机制(引自诺贝尔医学奖委员会)

1.2.3.1 转录后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing,PTGS)

PTGS是最普遍的一种沉默机制。此机制主要由siRNA介导[11]。病毒侵染的植物细胞中的dsRNA可能是单链RNA病毒的复制中间产物或是其二级结构形态。至于植物DNA病毒,其dsRNA可能是具有重叠互补序列的转录物经由退火形成的。在胞质中的Dicer酶或其类似物(Dicer-like,DCL)的作用下把长链dsRNA切割成siRNA,其具5′端磷酸和3′端羟基,此外每条单链的3′端均有2～3个突出的非配对的碱基[12-13]。由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体,即RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),然后siRNA作为引导序列,按照碱基互补配对原则识别靶基因转录的 mRNA,并引导 RISC复合体结合mRNA;接着siRNA与mRNA在复合体中换位,内切核酸酶将mRNA切割成21～23nt的片段,特异性地抑制靶基因的表达;另一方面,释放的siRNA可结合在靶mRNA上作为引物,在 RdRp(RNA-dependentRNAPolymerase)的作用下合成 dsRNA,合成的新的dsRNA又可以发生RNAi现象,特异地降解靶mRNA[14-16],从而产生级联放大反应。

1.2.3.2 转录水平的基因沉默(transcriptionalgene silencing,TGS)

TGS机制是通过改变靶基因染色质的结构来实现的。许多研究表明,发生TGS的主要原因是启动子序列的碱基尤其是胞嘧啶的甲基化。siRNA通过碱基配对原理,指导 DNA甲基化酶结合到DNA的特异部位,引发该部位DNA中胞嘧啶的甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)及组蛋白H3赖氨酸9的甲基化[17-21],使靶启动子失去功能,导致下游基因转录沉默。另外,DNA甲基化可以阻止转座酶的生成,从而抑制转座子的移动,保持遗传稳定,防止遗传损害[22]。

1.2.3.3 翻译水平的基因沉默

这种机制主要是由内源的miRNA介导的基因沉默。miRNA是由长度约70nt的RNA形成的茎环样前体,经Dicer酶作用后形成长约21～25nt的单链RNA,大多数miRNA与底物mRNA不完全配对结合,它们并不改变miRNA的稳定性[23-24]。这种抑制方式最终也通过形成RISC发挥作用,结合在相应的 mRNA的3′末端非翻译区(3′-UTR)上,对靶基因进行转录后的负调控,而靶mRNA并不发生变化,所以属于一种翻译水平上的抑制效应[25-26]。miRNA和siRNA相同,除了都由Dicer酶加工成熟之外,RNAi必需的Argonaute(alg-1、alg-2)家族基因也是这两种RNA行使生物功能所必需的。在RNAi过程中形成的RISC复合物既含有siRNA又含有miRNA,此复合物可根据不同情况产生不同效应,若siRNA与靶序列不能严格配对(如有单个碱基错配),则PTGS无法进行,此时复合物转而利用miRNA抑制核糖体在mRNA上延伸从而在翻译水平阻断基因表达[27]。

2 RNAi技术在植物抗病毒研究中的应用

RNAi技术目前已经广泛应用于植物病毒的防治上。1998年,首次报道了RNAi技术在防治马铃薯Y病毒病上的应用,Waterhouse等人利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS(inverted repeatsequence)载体进行烟草转化,使植株完全免疫[28]。

dsRNA为RNAi的诱导起始物。生物体由于病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录以及外源基因导入等原因都可能产生dsRNA分子。dsRNA的产生有化学合成法、体外转录法和转录载体体内转录法。现在普遍采用转录载体体内转录法。

2.1 RNAi表达载体的构建

2.1.1 靶基因序列的选择

构建高效的RNAi表达载体是应用RNAi技术的关键。其中导入的 dsRNA具有特异性是利用RNAi的前提,在保证不影响其他功能的前提下降解病毒基因组。这种特异性是由dsRNA与目的基因的同源序列决定的,所以如果在植物体内还有另外的基因与RNAi作用的基因有同源性,这个基因必定也会受到 RNAi的影响。另外,对于 RNAi的作用位点要经过精心选择。位点选择不当还常常会导致脱靶效应(off-targeteffect)。由于siRNAs和靶mRNA可以有一定的错配和间隙,因此siRNAs可能在一个基因组中作用于上百个潜在的目标序列[29]。现在已经发展出若干种算法和软件帮助选择特异的siRNA靶序列[30],运用科学并相对先进的技术可以帮助尽量避免脱靶效应的产生。目前,RNAi技术在植物抗病毒研究中,主要从两方面来设计RNAi作用的靶位点：1)以病毒基因组序列为靶位点设计dsRNA,来起到抑制的作用;2)以宿主植物的基因组序列为靶位点设计dsRNA,来起到抑制的作用。前一种方法目前研究和应用的比较多,它是将植物病毒基因组的一部分片段作为RNAi作用的靶位点来设计 dsRNA,从而达到抗病毒的目的。Shuichiro[31]等人分别以马铃薯X病毒(Potato virusX,PVX)的外壳蛋白基因和TGBp1基因(这个基因编码RNA沉默抑制因子)为靶位点来设计siRNA,他们分别选取了这两个基因的部分片段设计成可产生发夹结构的反向重复序列,结果表明这两种siRNA都能干扰PVX的侵染。后一种方法研究和应用的比较少,因为它需要在对宿主植物某些基因功能了解比较清楚的前提下进行。

2.1.2 dsRNA表达结构

对于dsRNA表达结构,人们多采用基因片段反向连接成反向重复序列的方法,可使表达的单链RNA自我配对形成发夹结构RNA(hpRNA),发夹茎部形成稳定的dsRNA可诱导同源的内源基因沉默。通常在片段之间需存在一段间隔区,以便使载体结构更加稳定。而用正义方向连接的内含子序列替代hpRNA间隔区,形成带有内含子结构的ihpRNA(intronsplicinghpRNA)载体,其沉默效率可达到90%以上[32]。Wesley等[33]对此进行了深入的比较研究,其结果表明长度为98～853bp的靶基因反向重复片段能够高效地导致沉默,其转化体沉默效率可达66%～100%(平均90%)。另外启动子强弱对于外源基因的表达水平也有很重要的影响,在构建准备转化禾本科植物(如水稻)的表达载体时,可用Ubiquitin启动子等,以获得较高的干扰程度[34]。

2.2 RNAi技术在抗水稻条纹叶枯病毒中的应用

利用RNAi技术赋予植物体病毒抗性具有高度可行性,目前已有通过RNAi技术获得抗性的报道。如Pinto等[35]将南方菜豆花叶病毒属的水稻黄斑驳病毒(Riceyellowmottlevirus,RYMV)复制所需酶的部分基因通过构建载体而转化水稻,诱发基因沉默,从而使植物具有对RYMV的抗性,并且这种抗性能稳定遗传3代。马中良等[36]根据抗水稻矮缩病毒(Ricedwarfvirus,RDV)序列,构建了与其相关的RNA干扰序列,导入水稻中,发现对水稻矮缩病毒有很高的抗性。

转病毒外壳蛋白cp基因策略是研究最早、应用最广泛的抗病毒手段。Hayakawa等[37]和燕义唐等[38-39]将条纹叶枯病毒的cp基因分别导入到粳稻和籼稻中,发现表达外壳蛋白基因的转基因水稻植株对 RSV的侵染起到一定的抗性。研究表明,当RSV侵染水稻后,伴随着病症的加剧,植物细胞内病毒的外壳蛋白CP和病害特异性蛋白SP发生积累,而其他病毒蛋白的积累并不明显,因此推测这两种蛋白都是致病相关蛋白[40]。刘利华等[41]应用免疫胶体金电镜技术发现病毒的CP和SP在寄主组织细胞中的叶绿体和细胞质中都有存在,线粒体中没有,而细胞核中只有CP分布,这表明CP极有可能是病害的致病相关蛋白,甚至致病性方面比SP更为重要;并且还发现在叶肉组织细胞壁的胞间连丝中存在CP,据此推测CP也可能与病毒的运输有关。因此,目前在利用RNAi技术抗水稻条纹叶枯病毒中经常选取病毒的cp基因作为靶位点。代玉华等[42]以水稻条纹叶枯病毒的cp基因为靶标,通过将载体pMCG161和载体pCAMBIA1301双酶切和连接,构建了一个具有CaMV35S启动子并且在正反义链中间含有一个水稻内含子适于水稻农杆菌转化的高表达RNAi载体。张恭等[43]利用已公布的水稻条纹叶枯病毒的序列和siRNATargetFinder软件,获得了168条siRNA片段,利用这些片段在水稻基因组中BLAST,最终获得6条与水稻基因组完全不匹配的干扰序列。选择其中的2条,通过化学合成干扰序列,利用pCAMBIA1301质粒构建了2个RNA干扰载体。这些研究为探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。

3 结语

RNAi技术已经高效地应用于能够沉默特定植物基因的分子植物育种,并被Science杂志评为2001、2002年度自然科学十大突破之一[44],为目前分子生物学和遗传学研究热点。正如诺贝尔生理学或医学奖评奖委员会主席戈兰◦汉松说：“我们为一种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的发明家证明是正确的,是给它发个诺贝尔奖的时候了。”RNAi技术发展迅速,以上的研究也说明RNAi技术在应用于抗水稻病毒研究中的巨大潜力。但RNAi也有其自身的不足之处。研究证实即使是有一个碱基的突变,也会对干扰的效果产生巨大的影响[45]。siRNA的脱靶效应也是进行RNAi试验时需要注意的一个问题[46-47]。并且对于RSV的各基因产物的功能及其在致病性中的作用等方面的研究还很少。尽管仍有一些问题亟待研究,但随着分子生物学方法和技术的发展,可以预见上述问题必将一一得到解决,有理由相信利用RNAi技术将在水稻病毒基因功能研究和水稻抗病品种的培育方面发挥重要作用。

[1]吴书俊,钟环,左慧,等.水稻抗条纹叶枯病的遗传与育种研究进展[J].中国农学通报,2007,23(1)：244-248.

[2]Wingard S A.Hosts and symptoms of ring spot,a virus disease of plants[J].Agric Res,1928,37：127-153.

[3]Fire A,Xu S,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391：806-811.

[4]彭昊,王志兴,窦道龙,等.由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻[J].农业生物技术学报,2003,11(1)：16-19.

[5]Plasterk R H.RNA silencing：the genomes immune system[J].Science,2002,296(5571)：1263-1265.

[6]Hutvagner G,Zamore P D.RNAi：nature abhors a doublestrand[J].Curr Opin Genet Dev,2002,12：225-232.

[7]Beclin C,Boutet S,Waterhouse P,et al.A branched pathway for transgene-induces RNA silencing in plants[J].Curr Biol,2002,12(8)：684-688.

[8]Li J,Yang Z,Yu B,et al.Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3'-end uridylation activity in Arabidopsis[J].Curr Biol,2005,15(16)：1501-1507.

[9]Park M Y,Wu G,Gonzalez-Sulser A,et al.Nuclear processing and export of microRNA in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(10)：3691-3696.

[10]Baulcombe D.RNA silencing in plants[J].Nature,2004,431：356-363.

[11]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants[J].Science,1999,286：950-952.

[12]Zamore O D.RNA interference：listening to sound of silence[J].Nat Struct Biol,2001,8(9)：749.

[13]Harborth J,Elbashir S M,Becheft K,et al.Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs[J].J Cell Science,2001,114(24)：4557.

[14]Zamore P D,Tuschl T,Sharp P A,et al.RNAi：doublestranded RNA directs the A TP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,2000,101：25-33.

[15]Winston W M,Molodowitch C,Craig P H.Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane protein SID-1[J].Science,2002,295(5564)：2456-2459.

[16]Jia S,Noma K,Grewal S I.RNAi-independent heterochromatin nucleation by the stress-activated ATF/CREB family proteins[J].Science,2004,304(25)：1971-1976.

[17]Wassenegger M,Heimes S,Riedel L,et al.RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants[J].Cell 1994,76：567-576.

[18]Mette M F,Aufsatz W,van der Winden J,et al.T ranscriptional silencing and promoter methylation triggered by doublestranded RNA[J].EMBO J,2000,19：5194-5201.

[19]Jones L,Ratcliff F,Baulcombe D C.RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance[J].Curr Biol,2001,11(10)：747-757.

[20]Verdel A,Song tao J,Gerber S,et al.RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the R1TS complex[J].Science,2004,303(30)：672-676.

[21]Buratowski S,M oazed D.Gene regulation：expression and silencing coupled[J].Nature,2005,435：1174-1175.

[22]Zeng Y,Wagner E J,Cullen B R.Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when ex pressed in human cells[J].Mol Cell,2002,9(6)：1327-1333.

[23]Volpe T A,Kidner C,Hall I M,et al.Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi[J].Science,2002,297(5588)：1833-1837.

[24]Denli A M,Tops B B,Plasterk R H,et al.Processing of primary micro RNAs by the microprocessor complex[J].Nature,2004,432(7014)：231-235.

[25]Bartel D P.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2)：281-297.

[26]Bernstein E,Caudy A A,Hammond S M,et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature,2001,409(6818)：363-366.

[27]Hannon G J.RNA interference[J].Nature,2002,418(6894)：244-251.

[28]Waterhouse P M,G raham M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(23)：13959-13964.

[29]M a Y,Creanga A,Lum L,et al.Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens[J].Nature,2006,443(7109)：359-363.

[30]Boese Q,Leake D,Reynolds A,et al.Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design[J].M ethods Enzymol,2005,392：73-96.

[31]Takahashi S,Komatsu K,Kakizawa S,et al.T he efficiency of interference of Potato virus X infection depends on the target gene[J].Virus Research,2006,116：214-217.

[32]Smith N A,Singh S P,Wang M B.Total silencing by intronspliced hairpin RNAs[J].Nature,2000,407(6802)：319-320.

[33]Wesley S V,Helliwell C A,Smith N A,et al.Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants[J].Plant J,2001,27(6)：581-590.

[34]Chuang C F,Meyerowitz E M.Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana[J].PNAS,2000,97(9)：4985-4990.

[35]Pinto Y M,Kok R A,Bandcombe D C.Resistance to Rice yellow mottle virus(RYMV)incultivated African rice varieties containing RYMV transgenes[J].Nature Biotechnology,1999,17(7)：702-707.

[36]马中良,杨怀义,王荣,等.利用转hpRNA基因水稻抗水稻矮缩病毒[J].植物学报,2004,46(3)：332-336.

[37]Hayakawa T,Zhu Y,Itoh K,et al.Genetically engineered rice resistant to Rice stripe virus,an insect-transmitted virus[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89：9865-9869.

[38]燕义唐,王晋芳,邱并生,等.水稻条纹叶枯病毒外壳蛋白基因在工程水稻植株中的表达[J].植物学报,1992,34(12)：899-906.

[39]Yan Y T,Wang J F,Qiu B S,et al.Resistance to Rice stripe virus conferred by expression of coat protein in transgenic indica rice plants regenerated from bombarded suspension culture[J].Virologica Sinica,1997,12(3)：260-269.

[40]林奇田,林含新,吴祖建,等.水稻条纹病毒外壳蛋白和病害特异性蛋白在寄主体内的积累[J].福建农业大学学报,1998,27(3)：322-326.

[41]刘利华.三种水稻病毒病的细胞病理学[D].福州：福建农林大学,1999.

[42]代玉华,王锡锋,李莉,等.一种适合水稻农杆菌转化的 RNAi载体的构建和潮霉素对水稻转化的影响[J].植物保护,2007,33(2)：37-40.

[43]张恭,刘立峰,周维,等.水稻条纹叶枯病毒 RNA干扰载体的构建[J].华北农学报,2008,23(4)：10-13.

[44]江舸,金由辛.微 RNA—Science杂志2002年十大科技突破第一名[J].生命的化学,2003,23(1)：1-3.

[45]Du Q,Thonberg H,Wang J,et al.A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites[J].Nucleic Acids Res,2005,33(5)：1671-1677.

[46]Saxena S,Jonsson Z O,Dutta A.Small RNAs with imperfect match to endogenous mRN A repress translation.Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells[J].J Biol Chem,2003,278(45)：44312-44319.

[47]Ma H T,On K F,T sang Y H,et al.An inducible sy stem for expression and validation of the specificity of short hairpin RNA in mammalian cells[J].Nucleic Acids Res,2007,35(4)：e22.