老龄与年轻大鼠脑出血后脑损伤神经缺失的研究

孟凡超 娄季宇

1)郑州市第三人民医院神经内科 郑州 450000 2)郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014

随着世界人口老龄化,脑血管病(cerebrovascular disease,CVD)的发病率逐年升高,引起了世界各国人们的关注。有研究报道,在所有的脑血管疾病中,缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)发病率最高[1]。脑出血(Intracerebral hemorrhage ICH)是常见的致死性卒中类型,大多是老年性疾病,既往和目前的实验性脑出血研究一直沿用年轻大鼠动物模型,有研究表明老龄是影响动物及人类缺血性脑损伤的重要因素[2-3]。但老龄是否影响脑出血后脑损伤,目前尚未见有人在动物模型方面进行系统研究。本研究观察年龄对脑出血后脑损伤和神经功能缺失的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器 Narishige型立体定向仪(日本),微量进样器(上海医用激光仪器厂),显微外科手术器械(上海医疗器械厂),神经评分器械(自制)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物与分组:(1)实验动物的选择 实验动物选自河南省实验动物中心提供的年轻3月龄和老龄16月龄雄性SD大鼠,体质量分别为280～350 g和600～680 g。(2)动物分组 年轻、老龄SD大鼠各 6只分别于6 h、12 h、24 h、72 h、7 d、14 d进行神经功能评分。

1.2.2 大鼠尾状核脑出血模型建立和成功的标志 :采用改良的自体股动脉取血并脑内注射的方法。10%水合氯醛(400mg/kg)腹腔内注射麻醉;首先在操作台上切开右股部皮肤,切口长10～15 mm,分离肌肉、神经,暴露股动脉后将大鼠俯卧位固定在立体定向仪上。按照包新民[4]等报道的定位方法,使上门齿钩平面比耳间线平面低2.4 mm。调节定向仪使前后囟在同一水平面上,头部正中切开皮肤,长约15 mm,3%双氧水剥蚀骨膜,暴露前后囟门。于前囟前0.2 mm,中线右侧旁开3.5 mm处齿科钻钻一直径约1 mm的小孔,不伤及硬脑膜。微量注射器抽取100μl股动脉未凝血并局部压迫止血,将微量注射器固定于立体定向仪上,自钻孔处垂直进针,深度5.5 mm,以10μl/min速度向大鼠尾状核内推注,推注完毕后留针10min,以免血液自针道反流,退针后,骨蜡封闭钻孔,缝合切口。

1.2.3 动作测评实验:所有动物均由不知情的实验者在手术前后对神经状况进行评分。模型成功后分别于术后6 h、12 h、24 h、72 h、7 d和 14 d对神经状况进行评分 。

1.2.4 前肢放置试验:使用撩拔触须引发前肢放置而进行评分,每个前肢通过每次撩拔同侧触须引发同侧肢体放置桌面的次数,每个前肢测10次。测定成功放置反应的百分数。对侧前肢造成脑出血的一侧成功放置反应降低。

1.2.5 前肢使用不对称测验:通过对放置于透明圆筒的大鼠录相3～10min,依其在实验中的活动程度,分析前肢在探索活动中的使用情况,前肢使用的几率决定动作活动。非削弱前肢的使用几率以其在筒壁上观察到的肢体使用的百分数[I]表示;削弱前肢的使用几率以其在筒壁上观察到的肢体使用的百分数[C]表示;双侧前肢同时在筒壁上观察到的肢体使用的百分数[B]表示,大体上单个肢体使用不对称分数计称为(I/I+C+B-C/I+C+B)。转角试验:让大鼠进入一个带30°角的转角通道,大鼠能够转向左或右边,在出口处记录左、右转的次数。每次试验至少30 s,重复10～15次,计算右转的百分数。

1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行数据处理,所有数据均采用均数±标准差()表示,采用Student t检验,取α=0.05作为显著性检验标准。

2 结果

动作测评实验:采用前肢使用不对称、前肢放置和转角试验评价动作行为缺失,大鼠自体全血注射后6 h～14 d进行检查,实验表明脑出血后经过24 h神经行为学上的缺乏,但进行性神经功能恢复在2周以上。初期的(24 h)动作行为缺失,经前肢放置得分评分、前肢使用不对称得分评分,老龄与年轻大鼠比较差异明显(图1,2),老龄组这一差异可持续至脑出血后2周(图1,2,3)。脑出血不影响同侧的(未受损的)前肢放置。与另外的2组测试对比,脑出血后转角试验得分神经功能恢复的证据很少,得分接近百分之百,除14 d之外在老龄组之间得分没有显著的差异,在此之间老龄组大鼠有显著的神经功能缺失(图3)。

神经行为学的评定包括脑出血后年轻和老龄大鼠前肢使用不对称(图1)、前肢放置(图2)和转角试验(图3),实验数据用均数±标准差()表示,与年轻大鼠比较*P＜0.05;#P＜0.01

3 讨论

3.1 脑出血动物模型制作方法的选择及其意义 利用立体定向手术向脑内注入胶原酶或自体血方法制作的脑出血动物模型与人类脑出血发病情况较接近,且出血量及出血部位的重复性较好,故应用较多。立体定向下向脑内植入可充胀的微气囊常用于模拟脑出血的占位效应及手术清除血肿过程的研究。自发性脑出血动物模型具有类似人类高血压动脉硬化的病理生理基础,但出血量及出血区域无法控制,故应用极少。

脑内直接注入自体动脉血或凝血块是最常用的脑出血模型。该模型适合于研究脑出血的占位效应、脑水肿及来自血管的活性物质等在脑损伤中的作用。关于动脉血的选择,常用的有:(1)剪尾取血:其血液成份多为静脉血和小部分动脉血,也有组织液,成份复杂,与临床丘脑出血是动脉破裂出血的血液内容不符;(2)尾动脉取血:手术创伤小,不影响大鼠肢体的功能,使行为学评分更准确;取血成功率较难控制。(3)股动脉取血:股动脉血作为供血动脉,取血成功率较高;但是手术创伤,影响取血下肢功能,使对大鼠的下肢行为学观察困难。

目前仍缺乏既有类似人类高血压、动脉硬化的病理生理基础,又较接近人类脑出血发病情况,并且出血量及出血部位均有较好重复性的脑出血动物模型。脑出血恢复期的动物模型则更加缺乏。况且目前大多数实验性脑出血模型使用的是年轻动物,而脑出血大多是老年性疾病,这一模型缺乏老年状态下的脑出血病理基础,不能较完备地模拟临床疾病过程。已有实验证明[5],年龄在其他脑损伤形式中是非常重要的因素,影响小胶质细胞和星形胶质细胞的活化及可塑性。老龄是否影响脑出血后脑损伤,目前尚未见有人在动物模型方面进行系统研究。本实验动物模型的制作是Hua[6]等方法,用年轻(3个月龄)和老龄(16个月龄)雄性 SD大鼠自体股动脉全血100μl注入尾状核制作脑出血动物模型,然后观察与年龄相关的神经缺失的变化。设想年龄因素对脑出血后脑损伤及其损伤后的神经功能恢复具有重要影响,探讨年龄对脑出血后脑损伤机制的影响,从而可能为制做合理的脑出血动物模型寻找新途径。

3.2 脑出血损伤与神经行为学改变 脑出血后24 h神经功能缺失,但进行性功能恢复需在2周以上,初期的(24 h)动作行为缺失,经过前肢放置得分评分、前肢使用不对称得分评分进行评价,老龄与年轻大鼠比较差异明显(图1,2),老龄组这一差异持续脑出血后2周(图1,2,3),脑出血不影响同侧的(未受损的)前肢放置。与另外的2组测试对比,脑出血后转角试验得分神经功能恢复的证据很少,得分接近百分之百。在老龄组之间除14 d之外得分没有显著的差异,在此之间老龄组大鼠有显著的神经缺失。脑出血后神经功能恢复依赖于大脑可塑性。大脑可塑性并不是简单的形态学改变,而是存在于整个生命过程的多种变化,有多种脑细胞参与,包括神经细胞、神经胶质细胞及大脑中的血管内皮细胞等。健康人的皮质代表区会因为训练和运动技巧的获得而发生修饰,类似的神经修饰同样也可由神经系统的损伤所引发[7]。这种神经系统可随环境改变而发生适应性变化的特性称为可塑性[8]。从1930年Bach提出脑的可塑性理论至今,有关脑可塑性的理论有替代论、远隔功能抑制论、神经发芽论、突触功能调整论、神经再生微环境变化论[9],这些理论各有侧重地阐述了大脑损伤后功能恢复可能的机制。不同年龄的人或动物其大脑可塑性是不一样的,具有很明显的“年龄依赖性”。脑出血后神经缺失起源于损伤与修复的平衡,有研究表明脑出血后时间依赖性的神经功能恢复很可能源于其可塑性[10],研究表明老龄神经功能可塑性程度普遍的降低[11]。因此,老龄动物更多的神经缺失可能反应最初的损伤或神经功能恢复能力的变化,老龄动物脑出血的效应可能由早期损伤和神经功能恢复能力衰减的复合作用而加重。总之,澄清年龄对脑出血后脑损伤的影响有助于为出血性脑损伤制定新的治疗策略。

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[10]Hua Y,Schallert T,Keep RF,et al.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat[J].Stroke,2002,33(10):2478-2484.

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