人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养*

张 臣 李 彤 侯跃龙 严晓晔 高英堂

人的内皮细胞是血管壁的主要组成部分，在维持组织稳态、纤溶与凝血、血液组织交换、血管舒缩调节、血管新生、血细胞激活和迁移等生理和病理过程中发挥着重要作用，另外在免疫反应起始过程中也起着决定性的作用[1]。因此体外获得血管内皮细胞可为阐明许多疾病血管并发症的病理过程提供重要研究模型[2]。新生儿脐带由于取材经济、来源充足,而成为血管内皮细胞体外获得的主要材料。本研究旨在建立一种简单、高效分离培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的方法，为进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司，中国），明胶（Sigma，USA），M199培养液和胎牛血清（FBS，Gibico，USA），CD34抗体（Miltenyi Biotec，Germany），人纤维连接蛋白（BD Biosciences，USA），FITC－CD31抗体（晶美生物公司，中国），PE－CD144抗体（eBiosciences，USA），血管性假血友病因子（vWF）抗体（Abcam，England），Dil－标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-AcLDL,Molecular Probes，USA）。EPICS ALTRA流式细胞仪（Beckman，USA）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的原代分离及培养 收集2009年2月—2009年7月我院健康产妇剖宫产后的15条脐带20～30 cm（产妇知情同意），立即放入4℃无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，分离培养在2 h内进行。在无菌条件下剪去破损或有夹痕、血肿部分，用PBS冲洗至静脉内无血，用止血钳夹住一端，另一端插管注入0.25%的胰蛋白酶，使之充盈后夹闭脐带，将其放入无菌容器内，37℃孵育10～15 min。收集消化液和消化后无菌PBS冲洗液，20℃～25℃1 200 r/min离心10 min,弃上清。用5～10 mL含20%血清的M199培养液重悬细胞，将细胞移入1.5%明胶包被过的培养瓶中，置于37．0℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中培养，24 h后换液，之后隔天换液。

1.2.2 HUVEC传代培养 原代细胞培养8 d左右，生长达80%～90%融合时进行传代培养。用PBS冲洗，加入0．25%胰蛋白酶消化，倒置显微镜下见细胞变圆、皱缩成团后加入200 mL/L胎牛血清的M199终止消化，用吸管轻轻吹打均匀成细胞悬液，按1∶2接种于培养瓶中。

1.2.3 HUVEC的鉴定 镜下观察细胞形态，取3代细胞进行表型鉴定和实验。贴壁内皮细胞用胰酶消化，1×105细胞重悬于50 μL的EP管，分别加入鼠抗人CD144、CD31、CD45、CD34单克隆抗体，阴性对照管不加一抗，室温闭光孵育30 min，1%多聚甲醛固定。流式细胞仪分析鉴定细胞。vWF抗体在用Trition-X100破细胞膜后加入，余步骤同上。

1.2.4 HUVEC的功能检测 取1、5代细胞培养6 d后，避光条件下加入浓度为10 mg/L的Dil－AcLDL，37℃孵育24 h。荧光显微镜下观察细胞摄取Dil－AcLDL的情况。

2 结果

2.1 内皮细胞形态学观察 消化分离的原代内皮细胞为成团的小圆形细胞，2 h开始贴壁生长，24 h细胞完全贴壁。贴壁细胞呈条索形，7～8 d细胞明显增多呈漩涡样生长，此后细胞继续增多接近融合呈铺路石样改变，见图1。细胞1∶2传代培养后，约10 d左右可长满瓶底达到80%～90%融合，继续传代，传6代后完成实验。

2.2 内皮细胞表型及功能鉴定 流式检测内皮细胞（P3）特异性标志物，高表达CD144（91．52±5．61）%、vWF（85．95±6．14）%、CD31（94．26±3．75）%，部分表达CD34（45．32±4．26）%，CD45表达阴性，见图2。用Dil－AcLDL与培养的内皮细胞共孵育24 h后，在荧光显微镜下观察，发现贴壁细胞中胞浆呈现红色荧光，而胞核不显色，证明细胞均摄取Dil－AcLDL（红色荧光标记蛋白），提示贴壁细胞为有功能活性的内皮细胞，见图3。

3 讨论

HUVEC获取的方法有机械刮取法[3]、组织块和酶消化法3种。前2种方法因混杂过多的杂细胞如纤维细胞、血细胞而被后者取代。酶消化法获取血管内皮细胞可采用胰蛋白酶、胶原酶或混合酶，胶原酶的作用较温和,消化过程中不易损伤内皮细胞，但价格昂贵、消化时间相对较长;胰蛋白酶消化作用强,对细胞有毒性作用,但其价廉。本实验采用胰蛋白酶消化法,实验中笔者将灌注胰酶的脐静脉两端封闭后放入37℃温水中，分别消化25 min、15 min、10 min，发现消化10 min后获得的内皮细胞生长活性好，其余消化时间获得的细胞在培养传代过程中逐渐失去活性而死亡。因此笔者认为只要掌握最佳消化时间、条件，并及时终止消化,就可以成功获得足够多的内皮细胞，这是保证实验成功的关键之一。

HUVEC较动物内皮细胞的培养困难,原代培养不易成功。实验过程中笔者认为需注意以下几点：（1）取下的脐带最好在2 h内将细胞分离完毕,这样能提高分离细胞的成活率。（2）内皮细胞具有相互接触促生长作用，因此细胞接种密度不能过低，实验中发现当细胞接种密度低于1×105/cm2时内皮细胞增殖能力明显减弱，传代后细胞不易成活。（3）采用明胶铺瓶能够促使内皮细胞贴壁生长，且细胞形态伸展良好。（4）传代时需把握胰蛋白酶的消化时间,防止酶对细胞的损伤。一般在细胞回缩变圆成团时即可终止消化,然后将细胞吹打下来。（5）实验中发现,随着传代次数的增加,细胞胞浆逐渐减少,胞核逐渐变大，细胞也变得较为扁平似铺路石样改变,尤其是传3代以上与原代细胞区别甚为明显，其原因有待进一步探讨。（6）在细胞培养过程中有研究者在培养液中加入生长刺激因子来促进细胞生长、贴壁[4-5]，笔者认为这些促进内皮细胞贴壁及生长的刺激因子加入后可能成为影响实验结果的混杂因素,限制内皮细胞的实验应用范围。因此实验中笔者采用无细胞因子含200 mL/L胎牛血清的M199培养液，发现内皮细胞生长和形态正常，并传5～6代后仍保持内皮细胞功能。

总之，本实验为体外研究药物对血管内皮细胞的作用机制以及研究心血管疾病的发生机制特别是在研究动脉粥样硬化发生的始动因素和分子机制提供了可靠的细胞模型，同时也为利用内皮细胞促进人造血管内皮化提供充足的细胞来源，从而提高小直径人造血管的血液相容性及远期通畅率。

[1]Yildirim S,Boehmler AM,Kanz L,et al.Expansion of cord blood CD34+hematopoietic progenitor cells in coculture with autologous umbilic vein endothelial cells(HUVEC)is superior to cytokine-supplemented liquid culture[J].Bone Marrow Transplant,2005,36(1):71-79.

[2]Meng X,Li ZM,Zhou YJ,et al.Effect of the antioxidant alphalipoic acid on apoptosis in human umbilical vein endothelial cells induced by high glucose[J].Clin Exp Med,2008,8(1):43-47.

[3]Quattrone S,Chiappini L,Scapagnini G,et al.Relaxin potentiates the expression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture[J].Mol Hum Reprod,2004,10(5):325-329.

[4]Marin V,Kaplanski G,Gres S,et al.Endothelial cell culture:Protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells[J].J Immunol Methods,2001,254(1-2):183-190.

[5]张小燕，梁朝，赵林，等.人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定[J].中华医学研究杂志，2005，5(6):386-389.