嗜酸乳杆菌的亚油酸异构酶基因克隆及其pMG36e表达载体的构建

郎建华 赵国芬 李志刚 郑 婷 包秋华

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是亚油酸(linoleic acid，LA)衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。其中cis-9、trans-11和trans-10、cis-11两种异构体被证实具有很强的生理活性，具有抗动脉粥样硬化、降低胆固醇、抗氧化、减肥、促进生长、缓和免疫反应副作用等优点。

20世纪80年代起，人们开始逐渐了解到，一些微生物细胞中的亚油酸异构酶 (linolenic acid isomerase,LAI)可催化亚油酸转化为共轭亚油酸的反应，并且反应产物均为活性共轭亚油酸异构体。亚油酸异构酶最早发现于溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）中，之后，又发现痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）、棒杆菌（Cornebacterium ssp）等能产生亚油酸异构酶。目前，有些菌种的亚油酸异构酶已被分离纯化。然而，这些菌种有些是厌氧的，不利于进行大规模的产酶培养；有些兼性厌氧菌生长较为缓慢，且生长会受到共轭亚油酸产物的抑制，并且传统的CLA工业生产大多采用化学方法,存在产物难以分离、产物中含有环化副反应、产品安全性低等问题，尚无法实际应用。于是，构建基因工程菌来表达亚油酸异构酶，就成为工业发酵生产共轭亚油酸的一条重要途径。

一些研究者开始将注意力转移到一些厌氧条件相对不是很严格的菌种，并陆续发现一些具有共轭亚油酸转化能力的兼性厌氧微生物，尤其是乳酸菌的研究和应用价值逐渐显现出来，目前，人们已发现乳酸杆菌属的多个种，如嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳酸杆菌保加利亚亚种（L delbrueckii subsp bulgaricus）、德氏乳酸杆菌亚种（L delbrueckii subsp Lactic）、罗伊氏乳杆菌（L reuteri）、干酪乳杆菌（L casei）、植物乳杆菌（L plantarum）,以及和乳杆菌密切相关的乳球菌属（Lactococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和丙酸杆菌属（Propionibacterium）的多个种都具有亚油酸异构酶活性。曹健、相丽新（2007）等已对嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的亚油酸异构酶基因克隆及表达进行了研究。

本实验将用嗜酸乳杆菌基因组为模板对LAI基因进行PCR扩增，之后克隆入pMD-19T质粒，再亚克隆到pMG36e质粒中，构建乳酸菌表达载体pMG36e-LAI，并转化到DH5 α中,为利用工程菌工业化生产高产量、高活性亚油酸异构酶制剂来生产CLA奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为本实验室从益生菌酸奶发酵剂中分离出的菌株。E.coli JM109，为内蒙古农业大学分子生物实验室保存，用于质粒pMG36e及其衍生质粒的保存。E.coli JM109（pMG36e）为内蒙古农业大学乳品楼生物实验室赠送。

1.1.2 培养基

LB培养基按照分子克隆实验指南进行配制。

1.1.3 酶及生化试剂

所用限制性内切酶SalⅠ、SphⅠ、异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)、X-Gal为大连宝生物公司产品。T4DNA连接酶、EX Taq DNA聚合酶、红霉素均为TaKaRa公司产品。

胶回收试剂盒为北京中科瑞泰公司产品，质粒抽提试剂盒为Tian Gen公司产品。DNA连接试剂盒、pMD19-T试剂盒、DNA Marker均为大连TaKaRa公司产品。

1.1.4 主要试剂及溶液

Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)、TE缓冲液(pH值8.0)、溶菌酶(20mg/ml)、SDS(10%、50 μl)、蛋白酶 K、NaCl(5 M100 μl)、CTAB/NaCl（10%/0.7 M）、酚/氯/异戊醇（25： 24： 1）、氯仿/异戊醇（24： 1）、预冷异丙醇 、预冷乙醇（70%）、氯化钙 。

1.1.5 引物

根据从国际基因库（Gen Bank）中下载的多条LAI基因序列，并结合国内董理等人的报道，利用Primer 5.0软件，针对pMG36e质粒的多克隆位点，设计了一对PCR扩增引物：

上游引物P1：

5'—AAAGTCGACATGTATTATTCCAAT-3'，（下 划 线为SalⅠ酶切位点）；

下游引物P2：

5'—AAAGCATGCTTAGACTAAATTTGCTTC-3'，（下划线为SphⅠ酶切位点）。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌总DNA的提取

用CATB法提取。

1.2.2 嗜酸乳杆菌LAI基因的PCR扩增

PCR反应条件：94℃预变性3 min，循环条件为：94℃变性30 s，47℃退火 45 s，72℃延伸2 min；循环30轮后，72℃保温6 min并终止反应。

1.2.3 LAI基因PCR产物的克隆及鉴定

用胶回收试剂盒纯化LAI基因PCR产物后和pMD19-T载体连接，转化用氯化钙法制备的感受态E.coli DH5 α，对阳性克隆用菌落PCR筛选及酶切鉴定。

1.2.4 LAI基因测序和氨基酸序列推测

筛选出含阳性克隆质粒pMD19-T-LAI的阳性菌，送北京三博远志有限公司进行序列分析并预测其氨基酸序列。

1.2.5 LAI基因新型表达载体的构建及转化

将LAI基因从pMD-19T-LAI克隆质粒上用SalⅠ、SphⅠ限制性内切酶切下，重新对应连接到用相同内切酶双酶切后的大肠杆菌/乳酸菌表达载体pMG36e上，并将重组质粒pMG36e-LAI转入E.coli DH5 α。

1.2.6 新型表达载体pMG36e-LAI的鉴定

挑选出转化平板上阳性菌落，并通过PCR扩增进行阳性克隆的初步筛选，然后提取阳性克隆的质粒进行双酶切分析。

2 实验结果与分析

2.1 LAI基因的PCR扩增

用针对LAI基因设计的特异性引物以嗜酸乳杆菌基因组为模板进行PCR扩增，电泳结果如图1所示，2号泳道得到一条长约1.8 kb的特异性目标带，符合LAI基因的预期长度（1 776 bp）。

图1 嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因的PCR扩增

2.2 LAI基因的克隆及酶切鉴定

图2 阳性克隆菌液PCR检测结果

图3 Sal I、Sph I双酶切电泳检测结果

将大量PCR产物电泳、凝胶回收并纯化后，直接与pMD-19T (2 692 bp)载体连接，然后转化E.coli DH5α，通过蓝白斑筛选，挑取白色阳性克隆菌。阳性克隆菌落PCR结果见图2。图2中1、3、4号泳道均得到一条长约1.8 kb的特异性条带，与预期的相同；提取其质粒SphⅠ、SalⅠ双酶切后，电泳检测结果见图3。图3中2、3号均为阳性克隆质粒（pMD-19TLAI）经过双酶切后，得到约1.8 kb和2.7 kb左右的片段，与我们插入的片段(1 776 bp)和质粒pMD-19T大小一致，1号为pMD-19T-LAI质粒，大小为4.4 kb，与预期的相符。证明阳性克隆质粒pMD-19T-LAI构建成功。

2.3 亚油酸异构酶基因测序及其氨基酸序列预测

将阳性克隆菌DH5 α(pMD-19T-LAI)提交北京三博远志公司进行克隆片段序列测定。

LAI基因序列测定及分析表明，ORF全长1 776 bp，编码591个氨基酸，编码蛋白的相对分子质量约67.6 kDa。

将该测定序列与Gen Bank中登录号为CP000033的嗜酸乳杆菌NCFM菌株的亚油酸异构酶基因序列进行比对，结果表明，该菌株亚油酸异构酶基因的核苷酸序列与NCFM中的核苷酸序列长度相同，都是1 776 bp，编码591个氨基酸，两段序列中在1 338位置有1个碱基不同，同源性高达99%，但所编码的氨基酸序列并没发生变化。

该基因测定序列与Gen Bank中登录号为DQ239438的嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株的亚油酸异构酶基因序列进行比对，结果表明，该菌株亚油酸异构酶基因的核苷酸序列与AS1.1854中的核苷酸序列长度相同，都是1 776 bp，编码591个氨基酸，两段序列中有4个碱基不同，同源性高达99%，导致所编码的氨基酸序列发生了变化。差别为该菌株编码的氨基酸序列第157为E(谷氨酸)，第286为F（苯丙氨酸），第506为V（缬氨酸）；而AS1.1854菌株编码的氨基酸序列对应的为G（甘氨酸）、C(半胱氨酸)、A（丙氨酸）。其中G和E，以及C和F两对氨基酸的极性不同，而A和V极性相同。

对该嗜酸乳杆菌和AS1.1854所编码氨基酸序列用Bioediter7.0进行疏水性分析,结果见图4。由于两蛋白质间只存在3个氨基酸的差别，因此，其疏水性谱非常相似,在两序列的N端均有一疏水区，可能存在信号肽。

图4 嗜酸乳杆菌株(a)和AS1.1854(b)亚油酸异构酶基因氨基酸疏水轮廓平均数图谱(Bioediter7.0)

2.4 LAI基因新型表达载体的构建及鉴定

图5 阳性克隆菌落PCR电泳结果

图6 双酶切质粒pMG36e-LAI电泳检测结果

将Sph I和Sal I限制性内切酶双切后得到的LAI基因和pMG36e电泳、回收、纯化、连接后转化感受态的E.coli DH5α，挑白色菌落进行PCR，结果如图5，1、2、3号泳道均得到1.8 kb的片段，与目的片段大小相同；提取阳性克隆质粒pMG36e-LAI进行双酶切结果如图6，图6中2号泳道出现了1.8 kb和3.4 kb左右的酶切片段，分别与目的片段 (1 776 bp)和pMG36e大小相同。图5和图6表明重组表达载体pMG36e-LAI构建并转化成功。

3 讨论

通过设计特异性引物扩增并克隆的LAI基因与现有报道的LAI序列高度相似，同源性为99%，可能是地域差异或不同亚种引起的，但预测的氨基酸顺序和疏水性分析表明，该氨基酸序列与报道的氨基酸序列一致。可以预测这个碱基的改变不会引起LAI基因功能的改变。

曹健等（2007）也对亚油酸异构酶基因进行了克隆与表达，不同的是他们利用的是嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株，表达载体是pET30a，转入到大肠杆菌BL21株中表达,在低温下诱导表达出重组蛋白,首次表达出了可溶性的亚油酸异构酶。

相丽新等（2007）利用植物乳杆菌 AS1·555,也克隆了亚油酸异构酶，并将其克隆到pQE30质粒载体上,进行测序，结果表明与已报道的痤疮丙酸杆菌共轭亚油酸异构酶分子量(55 ku)相差较大,但与罗伊氏乳杆菌(70 ku)和短双歧杆菌(70.5 ku)相近，其氨基酸序列与罗伊氏乳杆菌共轭亚油酸异构酶只有32%的同源性,与痤疮丙酸杆菌则没有显著同源性，说明了不同来源的共轭亚油酸异构酶可能也存在物种多样性或多形性。

4 结语

目前已成功构建大肠杆菌pMG36e-LAI新型表达载体，如果能成功在大肠杆菌中高效表达，可尝试转入乳酸菌工程菌MG1363，并获得大量表达，将为利用乳酸菌作为工程菌工业化生产获得大量、高活性亚油酸异构酶制剂，以及为研制多功能微生态制剂奠定基础，也为进一步构建食品级表达载体获得可食用益生菌剂提供理论依据。

15篇，刊略，需者可函索）