影响启动子活性测定的关键影响因素

李慧萍,姚兴伟,郭 楠,杨曦明

(北京中医药大学第一临床医学院检验科,北京 100700)

影响启动子活性测定的关键影响因素

李慧萍,姚兴伟,郭 楠,杨曦明*

(北京中医药大学第一临床医学院检验科,北京 100700)

目的探讨载体、质粒转染剂量、启动子长度、细胞系以及检测仪器等因素对启动子分析实验的影响。方法采用化学发光法测定荧光素酶,EGFP荧光强度采用流式细胞仪。以上检测每组样品均设三复孔,并重复两次,所得结果进行t检验。结果选择不同的报告基因、载体、质粒转染剂量、启动子长度和细胞系得到不同的结果。结论载体、质粒转染剂量、启动子长度、细胞系的选择会对启动子分析的结果造成很大的影响,因此,在进行启动子分析前,应综合考虑上述因素,以达到更好的实验效果。

启动子;报告基因;荧光素酶;绿色荧光蛋白

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1017)

真核基因的启动子是指RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件,它包括至少一个转录起始点以及一个以上的功能组件,这其中比较典型的有TATA盒(TATAAAA)、CAAT盒(GCCAAT)以及GC盒(GGGCGG)等。它位于基因翻译区的上游,属于调控基因表达的区域,通过启动子上的元件与对应该元件的转录因子的相互作用,精确调控着下游基因的转录,因此,启动子分析是转录调控研究中一种十分常用的技术,该项技术具有灵敏度高、实验周期短,可重复性强等特点。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人胚肺二倍体成纤维(2BS)细胞,由卫生部北京生物制品研究所建株。30代以下为年轻细胞,55代以上为衰老细胞;HeLa、MCF-7细胞为本室冻存。

1.2 载体选择与构建 将原构建于pSIR-EGFP-870(本室保存)的p16INK4a启动子(ATG上游870bp),经BamHI和XhoI双酶切,构建至pGL3(Promega)荧光素酶报告载体上,命名为pGL3-870;经SacI和XhoI双酶切,得到ATG上游620 bp片段,构建至pGL3载体上,命名为pGL3-620。

1.3 细胞转染 采用瞬时转染,所用质粒均经纯化(QIAGEN)。HeLa、MCF-7细胞的转染在24孔板中进行,2BS细胞的转染在六孔板中进行。转染试剂采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)。具体操作步骤参照说明书。转染后48小时收获细胞,用于后续实验。

1.4 报告基因检测方法 荧光素酶测定采用化学发光仪,以海肾荧光素酶作为转染效率的内参。取20 μ l转染细胞裂解液加入到96孔板中,加入100 μ l LARII测量萤火虫荧光素酶激发的荧光强度,再加入100 μ l Stop&Glo Reagent,测定海肾荧光值。取萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值作为最终结果进行组间比较。EGFP荧光强度采用流式细胞仪。以上检测每组样品均设三复孔,并重复两次,所得结果进行t检验。

2 结果

2.1 报告基因的选择对启动子活性的影响

为对比这两种报告基因在启动子分析上的性能,分别将 p16INK4a调控区 870 bp片段构建在EGFP和荧光素酶的上游,转染HeLa细胞。通过检测结果发现,尽管其它的实验条件相同,但所能测出的活性与各自的不含启动子对照组相比,却相差悬殊(图1):以荧光素酶为报告基因,实验组较对照组可增加10倍以上;而以EGFP为报告基因,实验组较对照组只增加大约60%。可见前者的灵敏度要比后者高得多。

图1 荧光素酶和EGFP检测p16INK4a.启动子活性的效果

2.2 载体对启动子活性的影响

以p33ING1为例,分别将其构建在pIRES,pCI,pcDNA3.1这三种真核表达载体上,然后与p16调控区上游870 bp的荧光素酶报告载体进行共转染,结果发现,在HeLa细胞中,这三种表达载体均可使位于p16启动子下游的荧光素酶表达下降,但尤以pcDNA3.1-p33最为显著,其幅度是其余两种的二至三倍,这样在荧光素酶的变化上就要从对照组的3-5倍相差到8-10倍,而这样的差别,会对实验的结论产生很大的影响(图2)。

图2 p33ING1载体对p16INK4a启动子活性的影响

2.3 质粒转染剂量对启动子活性的影响

一般而言,报告基因的活性随着其本身转染的剂量增加而增加(图3a);同理,对靶基因启动子的影响也会随着转录因子剂量的增加而效果越明显,但这也是在一定的线性范围内,否则也许会出现相反的结果(图 3b)。随着Sp3剂量的逐渐增加,p16INK4a启动子活性逐渐下降;而当Sp1的剂量达到0.8 μ g时,p16INK4a启动子的活性不但不再升高,反而开始下降。这主要与报告基因与转录因子的表达量有关,随着转染剂量的增加,表达增加,但当表达到一定程度后,将出现负反馈效应。

2.4 启动子长度对其活性的影响

一个基因的调控区通常很长,但一般真正起到调节基因表达强度的区域往往靠近转录起始位点。这样,在研究启动子活性的时候就不一定要对其全长进行研究,可以先搜索有无前人进行过这方面的研究,如果有,则直接选取活性最强的最短区域,如果没有,则从全长开始,每隔一段行5'删除,间隔区域视长度而定,越靠近转录起始位点,间隔得越小(100-200 bp),离得越远(1 000 bp)以上,间隔越大(500-1 000 bp)。

图3a 载体剂量对p16INK4a启动子活性的影响

图3b Sp1或Sp3剂量对启动子活性的影响

2.5 细胞系对启动子活性的影响

在实验中,除了HeLa细胞之外,我们还在不同代龄2BS以及MCF-7这两种细胞系中转染了pGL3-870。结果发现,年老2BS细胞中荧光素酶的活性高于年轻细胞10倍以上,而在MCF-7细胞中,则检测不出荧光素酶的表达变化(图4)。

图4 不同细胞系对p16INK4a启动子活性的影响

3 讨论

3.1 载体的影响

实验中,通常我们将注意力放到所要研究的目的转录因子和靶基因的启动子上,而很容易忽视转录因子所在的载体。图2显示,即便是相同的转录因子cDNA,构建在不同的载体上,其表达强度是不同的。这样的差别与载体骨架上本身的启动子种类、载体大小等因素有关,不同的启动子元件如CMV、SV40以及某些病毒的LTR有不同的启动转录的能力,因此造成下游基因蛋白表达的不同。因此这提醒我们:应当通过预实验,选择最理想的表达载体。

3.2 细胞系的影响

图4显示,相同的实验条件在不同的细胞系中所表现出来的启动子强度是不同的。一般来讲,启动子分析所选用的细胞系应该满足以下两个条件:一是具有较高的转染效率;二是该细胞系应当有待研究启动子基因的正常表达。所以在p16INK4a缺失的MCF-7细胞中是检测不到任何变化的,而年轻的2BS细胞本身p16INK4a的表达较年老细胞低很多,所以p16INK4a的启动子活性也是在年老时高,而年轻时低,而对于HeLa细胞,由于其较高的转染效率以及p16INK4a的完整性,报告基因的活性表现的极为明显。

3.3 转染剂量的影响

一般情况下,对靶基因启动子的影响会随着该转录因子剂量的增加而效果越明显,但这也是在一定的线性范围内,否则会由于该转录因子所在载体上启动子活性的累加而抑制待研究启动子的活性,再加之产生过多蛋白的负反馈抑制效应,最终出现相反的结果(如图3b显示的结果)。因此,在实验中,应当通过预实验摸一下转录因子的转染剂量,在兼顾各种质粒的总量和比例的前提下,选择转录因子发挥效果的最大剂量进行转染。

3.4 检测仪器的影响

对于荧光素酶的检测必须要有与之相匹配的仪器,尽管目前有一些可以用来测荧光的仪器,但由于荧光素酶的高灵敏度和很宽的线性范围(可达108),使得很多仪器事实上难以胜任启动子的分析,这样便使得原本可能很大的差异变小(由于已达仪器的上限,使得再高的表达也无法再测出)。

除上述因素之外,我们在实验中还发现,对于荧光素酶的测定,所需的样品量很少,往往在测完之后,还有很多的裂解液,如果将其弃掉,不免很可惜。通过定量分析发现,剩余的样品往往还可以做Western Blot,这样就可以一举两得,大大节约实验成本和时间。除此之外,在测定与分析启动子活性时,还需要考虑启动子区甲基化的问题。

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[2]Xue LX,Wu JF,Zheng WJ,et al.Sp1 is involved in the transcriptional activation of p16INK4 by p21Waf1 in HeLa cells[J].FEBS Lett,2004,564:199.

[3]Carey M,Smale ST.Transcriptional Regulation in Eukaryotes:Concepts,Strategies and Techniques[M].New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000:69-109.

[4]Hara E,Smith R,Parry D,Tahara H,Stone S.Peters G..Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence[J].Mol Cell Biol,1996,16:85.

Experience on Analyzing the Promoter Activity with Luciferase and Green Florence Protein

LI Hui-ping,YAO Xing-wei,GUO Nan,et al.(The First Clinical College Beijing University of Chinese Medicine,Beijing100700,China)

ObjectiveTo investigate the effect of vector,dose,inner reference,length of the promoter,cell line and the instrument to promoter analysis.Method Determine the luciferase with chemiluminescence and the fluorescence intensity of EGFP with flow cytometer.Each specimen be tested in three action-well and the testswere repeated twice.The result be checkedwith t-test.Result It would get different result when choose different reporter gene,vector,dose,enner reference,length of the promoter,cell line,and the instrument.ConclusionThe vector,dose,inner reference,length of the promoter,cell line and the instrumentwillmake great effect to the result of promoter analysis.Therefore,to get preferably result it isimportant to think the factor synthetic before the promoter analysis be done.

promoter;reporter gene;luciferase;green fluorescence protein

Q78

A

1007-4287(2010)07-1017-03

*通讯作者

2009-04-09)