丹参对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用机制的研究

黄 朔 ，李明振 ，张洪波 ，何其勇 ，姜 珊 ，金 琦

（1.佳木斯大学附属第一医院外科，黑龙江佳木斯 154002；2.佳木斯大学附属第一医院内科，黑龙江佳木斯 154002；3.佳木斯大学经济管理学院，黑龙江佳木斯 154003）

丹参对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用机制的研究

黄 朔1，李明振1，张洪波1，何其勇1，姜 珊3，金 琦2*

（1.佳木斯大学附属第一医院外科，黑龙江佳木斯 154002；2.佳木斯大学附属第一医院内科，黑龙江佳木斯 154002；3.佳木斯大学经济管理学院，黑龙江佳木斯 154003）

目的：探讨丹参对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法：雄性Wistar大鼠随机分为4组，假手术组，模型组（肾脏缺血再灌注损伤），治疗1组（肾脏缺血再灌注损伤前24 h给予药物），治疗2组（肾脏缺血再灌注损伤后12 h给予药物）。双侧肾动脉夹闭22 min，制作动物模型；比色法测定血清肌酐和血清尿素氮；Western blotting检测肾脏组织中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）的蛋白表达；TUNEL法检测肾脏上皮细胞凋亡。结果：模型组与假手术组比较，大鼠肾脏功能明显减退（P<0.05）；肾脏组织中，caspase-3蛋白质表达显著增加（P<0.05），大量肾小管上皮细胞凋亡（P<0.05）。再灌注前24 h给予药物，能够显著改善肾脏功能（P<0.05），并且显著下调caspase-3的蛋白表达（P<0.05），减轻肾脏上皮细胞凋亡（P<0.05），再灌注后12 h给药，不能改善肾脏功能，也不能显著下调caspase-3的蛋白表达（P>0.05）。结论：再灌注前给予丹参，能够抑制肾脏缺血再灌注损伤诱导的肾脏上皮细胞凋亡，对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。

缺血再灌注损伤；肾脏；凋亡

当前，多数学者认为，肾脏缺血再灌注损伤时，肾脏的上皮细胞会出现细胞凋亡，而细胞凋亡的主要途径为，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶依赖途径和非依赖途径两种[4]。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶依赖途径在肾脏的上皮细胞凋亡中发挥主要作用，在细胞凋亡中，会伴随caspase蛋白质家族的激活[5]。本研究着眼于丹参，作为一种传统中医药，对肾脏缺血再灌注大鼠的肾脏上皮细胞凋亡和肾脏组织caspase-3蛋白质表达的影响，探讨丹参对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用，为临床上防治肾脏缺血再灌注损伤提供新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

健康雄性Wistar大鼠20只，年龄6～8周，重量(180±20)g，12/24昼夜周期睡眠，由佳木斯大学实验动物中心提供（黑动字第99102001号，SPA方式饲养）。本实验应用的动物实验方法，获得了佳木斯大学附属第一医院医学伦理委员会的许可。

血清尿素氮和血清肌酐试剂盒，采购自中生北控生物科技股份有限公司。丹参注射液购自正大青春宝药业有限公司；caspase-3多克隆抗体（兔抗大鼠）购自美国GeneTex公司；β-actin多克隆抗体（兔抗大鼠）及羊抗兔二抗，均采购自北京康为世纪生物科技有限公司；TUNEL染色试剂盒，采购自德国BM公司。

1.2 动物模型建立

腹腔注射全身麻醉大鼠，麻醉剂为：1.25 mg/ml咪唑安定加0.08 mg/ml芬太尼，高效碘常规消毒，铺无菌手术单，取腹部正中切口，逐层切开止血，锐性分离，找到并且分离大鼠肾蒂，无创伤血管夹夹闭双侧肾脏动脉，产生肾脏缺血，开始计时，22 min后，松开血管夹，观察1 min，此时，肾脏的颜色由暗红色变成鲜红色，说明缺血再灌注模型已经制备，逐层缝合，关闭切口，整个过程在保温箱内进行，温度保持32°C，待大鼠苏醒后，给予0.15 mg/kg盐酸丁丙诺啡皮下注射镇痛，送回实验中心，分开饲养，自由饮食。

1.3 标本的留取

腹部正中切口，心脏穿刺采血，留取血清样本，冰箱中保存，双侧肾脏离体后，用冰0.9%NaCl溶液冲洗，迅速切开，一部分置于4%甲醛中固定，另一部分置于液氮中保存。

1.4 动物分组

实验动物分为4组：假手术组，与手术组一样操作，不夹闭肾动脉；模型组，肾脏缺血22 min后恢复血液供应；治疗1组，肾脏缺血再灌注前24 h，给予丹参腹腔注射6.25 ml/kg；治疗2组，肾脏缺血再灌注后12 h，给予丹参腹腔注射6.25 ml/kg。

1.5 肾脏功能测定

大鼠在切取肾脏标本后，心脏穿刺采血，断颈处死。应用比色法测定大鼠血清尿素氮和血清肌酐，操作方法，按照试剂盒上的说明进行。

1.6 Western blotting测定caspase-3

将收集的肾脏组织放入1.5 ml离心管内，加入1 ml单去污裂解液，成分为：50 mmol/L Tris(pH 7.4)（氨丁三醇），150 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100 （辛基苯氧基聚乙氧乙醇），1 mmol/L(PMSF)（苯甲基磺酰氟），冰水浴中超声匀浆，12 000xg，4℃离心15 min后，取上清液用Bradford法测定蛋白质浓度，进行蛋白质电泳分析。取100 μg蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度为12%（分离胶）和5%（积层胶），电泳结束后，将胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，250 mA转移2 h，将转印后的膜以封闭剂（5%脱脂奶粉，含吐温20的磷酸盐缓冲液配制）在室温下封闭2 h，将膜转入含工作浓度的一抗，caspase-3(1∶200)或 β-actin（1∶1 000）中缓慢振摇1h后4℃过夜，用磷酸盐缓冲液洗3次，每次5min，二氨基联苯胺均匀涂在膜上显色3 min，应用quantity one(Bio-Rad)软件进行吸光度定量，所得结果以β-actin为参考。

1.7 TUNEL法检测细胞凋亡

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End labeling(TUNEL)：终端脱氧核苷酸转移酶，生物素脱氧尿苷三磷酸，刻痕末端标记法，该方法检测DNA片段标记尾端核酸，通过检测终端脱氧核苷酸转移酶，生物素脱氧尿苷三磷酸，刻痕末端标记，推断细胞凋亡。肾脏组织用4%中性甲醛固定，过夜，脱水，透明，石蜡包埋，组织切片厚度6 μm，置于包被有多聚赖氨酸的载玻片上。染色按照试剂盒的说明进行。同时做阳性与阴性对照，苏木素再次对细胞核染色，凋亡程度以每个视野中阳性细胞数表示，每张组织切片随机抽取8个视野，每个肾脏观察3个切片。

1.8 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件进行分析，数据采用x±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，任意两组之间的比较采用SNK-q检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清尿素氮和血清肌酐的比较

见表1。模型组显著高于假手术组（P<0.05），动物模型建立成功。治疗1组与模型组相比较，肾脏功能得到明显改善，血清尿素氮和血清肌酐均明显降低（P<0.05），治疗2组与模型组相比较，肾脏功能无明显改善（P>0.05）。

表1 各组大鼠血清尿素氮和血清肌酐的比较结果（x±s）

2.2 各组大鼠肾脏组织中caspase-3蛋白质的表达情况

Western blotting印迹结果显示，假手术组，大鼠肾脏组织中，caspase-3活性片段的蛋白表达量很低 [caspase-3/βactin 为（0.10±0.03） mg]，模型组，蛋白质的表达量明显上调[caspase-3/β-actin 为（0.53±0.15） mg]，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。缺血再灌注前给药组，蛋白质的表达明显低于模型组[caspase-3/β-actin 为（0.35±0.07） mg]，差异有统计学意义（P<0.05），缺血再灌注后给药组[caspase-3/β-actin 为（0.53±0.16） mg]，与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 各组大鼠肾脏上皮细胞凋亡百分比

假手术组为(6±4)%，模型组为(36±4)%，再灌注前给药组为(20±4)%，再灌注后给药组为(28±6)%，模型组与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组与模型组相比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

染色显示，假手术组的大鼠肾脏组织中，不容易找到凋亡细胞。模型组大鼠的肾脏组织中，可以发现大量的凋亡细胞，与假手术组比较，差异有统计学意义。再灌注前给药组，大鼠肾脏组织中，凋亡细胞的数量与模型组比较，显著降低（P<0.05），再灌注后给药组，大鼠肾脏组织中，凋亡细胞的数量与模型组比较，无明显改变（P>0.05）。

3 讨论

缺血再灌注损伤，指组织或器官在缺血后，重新获得血液灌注，对组织或器官所产生的损伤作用。肾脏为血液高灌注器官，对缺血和缺血再灌注都非常敏感，很容易出现损伤。

肾脏缺血再灌注损伤时，由于能量的消耗，生长因子缺乏，活性代谢产物的大量产生，激活细胞凋亡途径，引起大量肾脏上皮细胞凋亡。适度的细胞凋亡，可以使机体保持细胞数量稳定，但过度的细胞凋亡，会使机体产生损伤。

对于该动物模型的制作，有的实验室[6]应用45 min和60 min的缺血时间，并且进行了对比，发现无明显差异，本研究小组，长期应用22 min，发现模型也很成功。

很多学者的研究指出，细胞凋亡的主要途径为：caspase依赖的途径和caspase非依赖的途径[4，7]。在肾脏缺血再灌注损伤中，诱导细胞凋亡的主要是caspase依赖的途径，包括：内源性凋亡途径、外源性凋亡途径和内质网途径，有效地抑制这些细胞途径，将减轻肾脏缺血再灌注损伤。caspase 3的信号是一个很灵敏的检测指标，可以在发生细胞凋亡的8 h内检测到，甚至有报道在24 h内出现54倍的最大值。

近些年来，有学者[8]直接在光学显微镜下，应用病理学分析来判断肾脏损伤，如，肾小管细胞肿胀，肾脏间质水肿，髓质充血，肾小管扩张。更加快捷，费用低廉。

丹参的记载，可以上溯到《神农本草经》，作为一种古老的药物，当代的学者在丹参对肾脏的药理作用方面进行了许多研究[9-10]，丹参对于肾脏的保护作用已经受到大家的重视。

本研究中，笔者采用健康雄性Wistar大鼠为肾脏缺血再灌注损伤模型。结果显示，与假手术组相比，肾脏缺血22 min后再灌注，大鼠的肾脏功能明显减退，组织中caspase-3蛋白质的表达明显增加，上皮细胞凋亡明显，证实动物模型制作成功。在缺血再灌注损伤前，给予丹参，血清尿素氮和血清肌酐，caspase-3蛋白质的表达明显低于模型组，上皮细胞凋亡也明显减少，表明，在再灌注前给予丹参，有保护肾脏功能的作用，及时掌握药物应用的时间，可以在很大程度上减少肾脏缺血再灌注损伤。这为预防和治疗肾脏缺血再灌注损伤，提供了新的思路和方法。

丹参取材容易，价格低廉，将为解决“看病难”、“看病贵”问题做出自己的贡献，我国古老的中医药也必将为提高人民的健康水平而不懈努力。

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Protection of Danshen on tubular cell induced by renal ischemia reperfusion injury in rats

HUANG Shuo1,LI Mingzhen1,ZHANG Hongbo1,HE Qiyong1,JIANG Shan3,JIN Qi2*(1.Department of Surgery,The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Heilongjiang Province,Jiamusi 154002,China;2.Department of Internal Medicine,The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Heilongjiang Province,Jiamusi154002,China;3.College of MBA,Jiamusi University,Heilongjiang Province,Jiamusi154003,China)

Objective:To investigate the protection of Danshen on tubular cell induced by renal ischemia reperfusion injury in rats.Methods:Male,Wistar rats were randomly divided into 4 groups:sham surgery group,model group(renal ischemia reperfusion injury group),medication group 1(drug given before renal ischemia reperfusion 24 hours)and medication group 2(drug given after renal ischemia reperfusion 12 hours).Renal ischemia reperfusion injury models were set up by clamping both sides of renal arteries 22 minutes.The level of serum creatimine and blood urea nitrogen was measured by colorimetry,protein expressions of renal cysteinyl aspartate-specific protease(caspase-3)were detected by western blotting.Cell apoptosis was confirmed by Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End labeling(TUNEL)analysis.Results:Comparing the sham group and the model group,the kidney function decreases sharply(P<0.05);protein expressions of caspase-3 increases remarkably(P<0.05);lots of tubular cell apoptosis(P<0.05).Using Danshen 24 huors before reperfusion was found remarkably improve renal function(P<0.05),decrease the expressions of caspase-3(P<0.05)and cell apoptosis(P<0.05).And using this medication 12 hours after reperfusion,administrating Danshen did not show us any effect on renal function,cell apoptosis,and the expressions of caspase-3(P>0.05).Conclusion:Before renal ischemia reperfusion,using Danshen for rats,that has the function of decompressing the cell apoptosis induced by renal ischemia reperfusion injury and protection the renal function.

Ischemia reperfusion injury;Kidney;Apoptosis肾脏缺血再灌注引起的肾脏损害，是一个临床上的常见病[1]， 在休克和肾脏移植患者中，是急性肾脏衰竭的最常见原因。过去40年中，休克患者的急性肾脏坏死率一直接近50%，无明显改变[2]。对于肾脏缺血再灌注损伤的治疗，仍为支持疗法，因此，改进治疗策略，预防肾脏缺血再灌注损伤，受到广大学者的关注[3]。

R-332

A

1674-4721（2010）11（c）-012－03

黑龙江省教育厅科学技术研究指导项目（11513110）。*

2010-10-08）