家兔微血栓栓塞中风模型的建立及应用

王维亭，于 冰，赵专友，汤立达

（天津药物研究院药效动力学重点实验室，天津 300193）

脑卒中发病率高、后果严重，是死亡与致残的最主要疾病之一。随着对脑梗死治疗的研究进展，逐渐认识到了多功能、多作用靶点治疗药物对于临床预后的优越性，尤其是兼具溶栓、降纤、血小板聚集抑制等多功能的药物，但目前对该类药物的研发尚缺乏合理的、有针对性的实验模型。本试验建立了一种可用于多功能药物药效学评价的新的微血栓栓塞中风模型，该模型适用于亚急性或慢性试验，并通过巴曲酶验证了其应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器、动物与试药

XHF－1型高速分散器（上海金达生化仪器厂）；HS3120型超声振荡器（天津市恒奥科技发展有限公司）；PK121R型低温冷冻离心机（意大利ALC公司）；Model550型光吸收酶标仪（美国Bio－RAD公司）；Parber凝血因子分析仪(北京世帝公司)。雄性新西兰大白兔，体重(2.0 ～2.7)kg，平均（2.4 ±0.2)kg，由天津药物研究院实验动物中心提供，动物合格证号为津实动质字第001号。巴曲酶[Batroxobin，5个巴曲酶单位（BU）/0.5 mL，北京托比西药业有限公司，批号为20041127]。组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）含量测定试剂盒（上海太阳生物技术公司，批号为41110）。

1.2 模型制备

微栓子制备：自供体家兔颈动脉取全血5 mL，凝固后置37℃水浴中老化3 h,取出血凝块,剪碎，悬浮于含0.1%小牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐生理盐水缓冲液（PBS）中,经高速分散器在5 000 r/min及10 s的条件下粉碎，收集通过230!m×230!m的尼龙筛网的微栓子,再经130!m×130!m的尼龙筛网过滤，将留于网上的血栓悬浮于PBS中备用。微栓子大小在130～230!m之间。

栓塞过程：取雄性家兔，体重（2.4±0.2)kg,乙醚麻醉后，仰卧位固定于手术台上，颈部去毛，分别以碘酒、酒精消毒手术野，颈正中线切开,分离皮下组织及筋膜；游离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。颈外动脉远端结扎，近段切口，插入充满生理盐水（NS）的PE50管并逆向行进至颈内动脉。取上述制备的不同量的微栓子，吸干称重后，悬浮于2 mL PBS中，快速推入脑内，再用5 mL NS缓慢冲洗。冲洗完毕后抽出插管并结扎颈外动脉切口，缝合手术伤口，肌肉注射青霉素(10万U)后，回笼饲养。

1.3 分组及给药

将动物分为3组，即模型组（A组）、巴曲酶低剂量组（B1组）、巴曲酶高剂量组（B2组），每组20只。栓塞造模后5 min，经耳缘静脉给药，给药体积5 mL,给药时间5 min。A组给予NS，B1组及B2组给予巴曲酶，剂量分别为0.5 BU/kg和1.0 BU/kg。

1.4 测定指标

致半数卒中微栓子量(ES50,effective stroke dose)：注射微栓子后出现神经症状者为异常动物（以1表示），无症状者为正常动物（以0表示）。药物治疗后6 h及24 h时，观察注射不同量微栓子后出现的异常卒中动物数，求出不同时间的 ES50，以此考察药物对脑卒中的治疗作用。

t－PA含量测定：造模前及给药后1 h，经心脏取血2 mL，以1/10体积的0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝，3 000 r/min转速低温(4℃)离心10 min，－20℃保存。采用酶联免疫吸附双抗体夹心法，用酶标仪在490 nm波长处测定光吸收度，计算t－PA含量。

纤维蛋白原（Fbg）含量测定：造模前及给药后1,2,4,6,24 h时，经心脏取血2 mL，以1/10体积的0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝，3 000 r/min转速低温(4℃)离心10 min，－20℃保存。采用凝固法测定Fbg含量。

脑出血观察：给药后24 h，耳缘静脉注射20%乌拉坦1 g/kg麻醉，开胸，分别用NS和4%多聚甲醛PBS依次经心脏灌注固定大脑，开颅取脑，置4%多聚甲醛PBS继续固定。1周后，将大脑沿冠状面切成5 mm厚的切片，依据下列标准盲法观察脑出血情况。出血类型分为4类，即蛛网膜下腔出血(SAH，在大脑表面的软脑膜下有肉眼可见的血液）、出血性梗死(HI，在松软的梗死组织中出现红色斑点）、点状出血(PT，在脑组织内出现散在的小红斑）、实质性脑内出血(ICH，脑组织内有大片的血液）。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 对 ES50及t－PA含量、Fbg含量的影响

结果见表1。可见，随着颅内注入微栓子量的增加，动物出现中风的几率明显增加，ES50值提示注入0.63 mg栓子6 h时即可使半数动物出现中风症状；予巴曲酶0.5 BU/kg治疗6 h及24 h后ES50,分别提高了2.2倍和1.8倍。A组t－PA含量在给药前及给药后基本保持稳定，有降低趋势；巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg给药后1 h可使t－PA含量明显增加，较A组分别增加14.04%和23.25%。A组Fbg含量在给药前及给药后基本保持稳定；巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg给药后可使Fbg含量明显降低，与给药前比较有显著性差异，以给药后6 h最为明显。

表1 各组 ES50及 t－PA含量、Fbg含量测定结果（n=20，±s）

表1 各组 ES50及 t－PA含量、Fbg含量测定结果（n=20，±s）

注：与 A 组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01；与给药前比较，□P ＜0.05，■P ＜0.01。

组别 剂量（BU/kg） ES50 t－PA(ng/mL)Fbg(g/L)A照 －B1组B2组0.5 1.0 6 h 0.63±0.57 1.41±0.51△2.00±0.59△24 h 0.52±0.54 0.93±0.65 1.44±0.47△基线2.42±1.04 2.39±1.00 2.38±0.69 1 h 2.28±0.85 2.60±0.96 2.81±1.08▲给药前3.47±1.06 3.53±0.70 3.51±1.31 1 h 3.53±1.17 3.13±0.93□2.88 ±0.72△□2 h 3.52±0.77 2.98±1.04□2.87 ±1.11△■4 h 3.53±0.70 2.87±1.26□2.84±1.15△□6 h 3.47±0.90 2.82 ±0.81△□2.63 ±1.27△■24 h 4.57±1.59 4.14±1.56 4.13±1.34

2.2 对脑出血的影响

结果见表2。可见，巴曲酶0.5 BU/kg及1.0 BU/kg给药后对脑出血类型及出血率无明显影响。

表2 兔大脑中动脉微血栓栓塞后出血类型及巴曲酶的作用（n=20）

3 讨论

大多数缺血性脑卒中是由血栓堵塞脑动脉所致，其中大脑中动脉是常见的栓塞血管。近年来，脑梗死溶栓治疗的临床应用及其病理生理机制探索有了较大进展，同时溶栓药物的研究及用于评价溶栓药物药效学的模型受到了极大关注，因此，建立稳定、客观、科学的动物模型对于溶栓药物研究具有重要意义。

目前，用于脑梗死溶栓药物评价的方法主要包括血管内注入复合血栓诱导剂[1]、光化学法[2－3]及注入血栓栓子法。血管内注入复合血栓诱导剂一般适用于小动物，观察指标较单一；光化学法需向动物体内注入光化学诱导剂，栓塞部位在皮层、呈弥漫性，且诱导剂对生化指标的检测有一定干扰；栓子注入法最常用，国内多采用大栓子栓塞法评价溶栓药溶栓的效果，一般为急性试验研究。注入血栓栓子栓塞大脑中动脉的方法，不需开颅，且较符合临床大血管栓塞特征。家兔是制作该模型的最常用动物，其颅内外血管之间无网状吻合，与狗或猫相比更接近于人类[4]，且动物温驯、血容量大，便于多指标研究。目前国内以家兔制作大脑中动脉血栓栓塞的方法一般采用大栓子，栓子规格为直径 0.5～1.0 mm、长 0.5～1.0 mm，栓子质量为 2.5 ～ 3.5 mg[5－6]。该模型一般用于急性脑梗死研究（＜24 h）,但不便于对脑梗死进行长期、动态的观察。笔者参考国外方法建立了一种新的模型，即微血栓栓塞模型[7－9]。该模型利用神经症状反应的量子关系（有或无）及几率，采用非线性拟合方法来评价药物的作用，避免了神经反应轻重程度判断的主观性，以及梗死程度与反应程度可能非正性相关的缺陷，同时可长期动态观察。国外研究者有观察至21 d的报道[10]。该模型上，少量微栓子栓塞大脑中动脉的范围较小，不引起家兔神经学行为异常；当栓子量加大时，栓塞范围也增加，动物出现行为异常的几率也增加，行为异常可表现为现眼球震颤、头倾斜或摆动、转圈、肢体偏瘫或失平衡、肌阵挛甚至死亡。

颈内动脉进入颅内后与Willis环相连，Willis环上血管分支较多，包括大脑前动脉及交通支、后动脉及交通支、椎动脉等。颅内血管分布复杂，从颈内动脉注入栓子后，栓塞的部位目前一般认为是大脑中动脉，而且被许多检测手段如数字减影血管造影（DSA）证实[11－12]，但国内、外对为何会栓塞到同侧大脑中动脉而不栓塞到其他血管的现象尚无科学合理的解释。为此，笔者结合实验现象、解剖学及流体力学提出了“对称结构与压力平衡”设想：脑底部Willis环是左右对称结构，位于大脑前动脉交通支中点及大脑后动脉交通支中点，该处左右压力相等，相互抵消，血流处于相对静止状态，即左右两侧血液互不流通。另外，大脑中动脉血流分布供应占大脑的2/3，占Willis环血流的绝大多数，即大脑中动脉血流为优势血流。在这些前提下，当颈内动脉栓子在等于或低于血压值的压力下进入颅内后，大多数血栓便随优势血流进入大脑中动脉，而不会越过交通支进入对侧，进入其他动脉的几率也较低。

巴曲酶是从蛇毒中提取的一种高纯度类凝血酶样物质，由231个氨基酸组成,能增加纤溶酶原激活剂的释放，降低提取血液中Fbg水平、降低血黏度、降低外周血管阻力，近年来广泛用于治疗缺血性脑血管疾病，治疗急性脑梗死的疗效肯定[13－14]。本研究结果表明，对于微血栓栓塞性脑中风模型，巴曲酶可明显提高 ES50值且能促进t－PA释放，这可能是其溶栓作用机制之一；同时也表明，该模型在评价脑梗死的溶栓、降纤等药物方面科学、合理，结果可靠。

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