乳酸菌自溶对切达干酪成熟中蛋白质分解的影响

孙卓，吕加平，张佳程，孔凡丕，李红娟

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.青岛农业大学食品科学学院，山东青岛266109）

乳酸菌自溶对切达干酪成熟中蛋白质分解的影响

孙卓1，2，吕加平1，张佳程2，孔凡丕1，李红娟1

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.青岛农业大学食品科学学院，山东青岛266109）

选取自溶度不同的乳杆菌作为附属发酵剂混合商业发酵剂制作切达干酪，研究了乳酸菌自溶对干酪成熟的影响。测定成熟期间各干酪中乳酸菌活菌数、pH值、pH4.6可溶氮质量分数和12%TCA可溶氮质量分数，并结合SDS-PAGE分析干酪蛋白质的水解情况。结果表明，各实验组干酪的12%TCA可溶性氮含量随着成熟时间延长逐渐增加，在1个月后不同组别之间差异显著（P＜0.05）。与对照组干酪相比，加入高自溶度菌株的实验组干酪蛋白分解程度较高，非蛋白氮的质量分数为8.00%。同时，SDS-PAGE结果显示，各干酪的蛋白质都有一定程度的分解，产物略有不同，乳酸菌自溶可以加速蛋白质分解。

自溶；附属发酵剂；蛋白质分解

0 引言

细菌自溶是指菌体细胞在一定的条件，自身释放可水解细胞壁肽聚糖网络状结构的自溶酶，这些酶的表达导致了细菌细胞壁质的溶解和消失，形成一个细胞内物质向周围环境释放的过程[1]。Law[2]研究表明在未成熟干酪中发酵剂自溶速率和自溶度与蛋白水解呈正相关，且对切达干酪的风味形成有积极作用，蛋白分解产生的小肽及氨基酸混合物将直接影响干酪的味道和口感。

为了加速干酪成熟以及提高风味，已有许多将乳杆菌作为附属发酵剂加入到切达干酪中的报道，如Hannon等人将快速自溶的瑞士乳杆菌作为附属发酵剂添加制作切达干酪，可以加速干酪成熟且切达干酪风味强烈[3-6]。本研究将干酪乳杆菌作为附属发酵剂添加制作切达干酪，研究其对干酪成熟的影响。

1 材料与方法

1.1 材料及设备

原料乳（新鲜无抗牛乳），直投式发酵R-704，供式菌株LB1，LB2，S1，5-2（本实验室储备菌株，经APIR标准微生物生化系统鉴定，均为副干酪乳杆菌），凝乳酶。

GE中低分子量蛋白marker，考马斯亮蓝G-250，甘油，Tris，SDS，β-巯基乙醇，TEMED，丙烯酰胺，双叉丙烯酰胺均为分析纯。EPS301电泳仪、Mini VE电泳槽、Alpha凝胶成像系统、FOSS2300自动凯氏定氮仪、Delta 320 pH，干酪槽等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及发酵剂的制备

菌种活化：将3株菌LB1，LB2，S1,5-2按2%的接种于质量浓度为100 g/L脱脂乳培养基中，37℃培养至凝乳。活化两代，置于4℃冰箱冷藏备用。

干酪按照添加发酵剂不同编号为A(只含R704)；B(含R704+LB1，高自溶度）；C（含有R704+LB2，中自溶度）；D（含有R704+S1,5-2，低自溶度）；其中R704的添加量为1 U/10L，附属发酵剂的添加量为1%。

1.2.2 切达干酪的生产工艺

原料乳→巴氏灭菌→冷却至32℃，添加发酵剂添加氯化钙→添加凝乳酶→切割、升温搅拌→保温搅拌→排乳清→堆酿→切碎加盐→压榨过夜→真空包装

1.2.3 乳酸菌计数

在成熟期中的7，15，30，45，60，75，90 d取样测定乳酸菌菌落总数[7]。

1.2.4 pH值的测定

样品处理按照文献[8]中方法进行，用Delta 320 pH计测定。

1.2.5 蛋白质水解程度的测定

在1，7，15，30，45，60，75，90 d分别取样测定pH值为4.6可溶性氮质量分数（pH4.6 SN）测定[9]和质量分数为12%的TCA可溶性氮(Non Protein Nitrogen，NPN)测定[10]。

总氮测定采用凯氏定氮法（GB5009.5-2003）。

1.2.6 SDS-PAGE凝胶电泳

取0.1 g干酪样品，加3.5 mL样品溶解液，沸水浴3 min后迅速冷却，磁力搅拌10 h后过夜，离心（2 000 g×20 min，4℃），去除上层脂肪，样品冷冻备用。取5 μL上样。分离胶浓缩胶质量分数分别为15%和6%。电压250 V凝胶电泳先15 mA再20 mA恒流下进行。电泳结束后在考马斯亮蓝R250溶液中染色2 h，然后用脱色液浸泡在摇床脱色过夜至背景清晰[11]。

样品缓冲溶液为[12]：60 mmol Tris-HCl（pH值为6.8）；体积分数为25%甘油；质量浓度为20 g/L的SDS；浓度为14.4 mmol/L的β-巯基乙醇；质量分数为0.1%溴酚蓝。

2 结果分析

2.1 各干酪理化成分

将装有灭菌乳的干酪罐进行编号，按1.2.1加入发酵剂，在同一干酪槽内统一制作完成。4种干酪的水分质量分数、蛋白质质量分数、脂肪质量分数及pH值均在典型的半硬质干酪指标范围内[13]。如表1所示。

表1 各干酪的理化成分测定结果

2.2 成熟期间乳酸菌总数变化

随着成熟时间延长，乳酸菌生长趋势如图1所示。图1中，在成熟初期2周内各干酪中乳酸菌总数维持在一定范围内（108～109g-1），且乳酸菌数相近。在15 d到1个月期间各干酪乳酸菌数下降至107g-1左右，在30 d之后，A对照干酪的乳酸菌数逐渐下降至6.0×106g-1，而干酪B、C、D的乳酸菌数量先上升后下降至相近（1.0～3.0）×108g-1，其中干酪B乳酸菌数最高。切达干酪的含水量少，发酵剂未发酵完的乳糖大多非发酵剂乳酸菌（Non-Starter Lactic Acid Bacteria,NSLAB），NSLAB对于切达干酪的品质有重要的作用[14，15]。添加附属发酵剂的干酪能在成熟期内维持较高的活菌数。

图1 成熟期间各干酪中乳酸菌总数变化

2.3 成熟期间pH值的变化

整体变化趋势是先下降后升高，然后趋于平缓。在干酪成熟一周内，pH值迅速降低，结合图1可知，在15天内各干酪中乳酸菌总数维持在较高水平，乳酸菌发酵产酸，使pH值有所下降，正如图2所示在第7天pH值降低至pH5.0左右，随后pH值逐渐升高，在90天时B和C具有较低pH值。而pH值是影响干酪中生化反应的重要因素之一。

图2 成熟期间pH值变化

2.4 成熟期内蛋白质水解程度的变化

图3为切达干酪在成熟期内非酪蛋白氮质量分数的变化。由图3可以看出，干酪C和D的非酪蛋白质量分数随着成熟期延长具有相似的变化趋势，随着成熟时间缓慢增加，而干酪B在15 d时具有较高质量分数的非酪蛋白氮质量分数。对照切达干酪A随着时间其蛋白质分解程度趋势平缓。pH4.6SN主要是凝乳酶和胃蛋白酶的作用形成的肽类以及纤溶酶活性，对引起的一定的蛋白质降解。由于添加的附属发酵剂不同，发酵剂产酸程度不同，凝乳酶的作用效果也不同，所以初始的pH4.6SN质量分数不同，但没有差异（P＜0.05）；在第75天，干酪A、B、C之间有显著差异，而干酪C和D没有显著差异（P＞0.05）。

图3 成熟期内非酪蛋白氮质量分数的变化

图4为切达干酪在成熟期内非蛋白氮质量分数的变化。由图4可以看出，各实验组干酪的12%TCA可溶性氮（非蛋白氮）含量随着成熟时间延长逐渐增加，与对照干酪相比，干酪B和干酪C具有较高的非蛋白氮质量分数。在1个月后不同组别之间非蛋白氮质量分数差异显著（P＜0.05），加入自溶度高菌株的干酪B的非蛋白氮的含量为8.00%，在对照干酪A中的含量为7.35%，变化表示着成熟干酪的次级蛋白质降解，此时高、中分子量肽类被降解成低分子量肽类以及氨基酸等。

图4 成熟期内非蛋白氮质量分数的变化

2.5 SDS-PAGE显示蛋白质水解的状况

图5为干酪B成熟过程中的SDS电泳结果；图6为干酪A，B，C，D在75 d和90 d的SDS电泳结果。由图5和图6可以看出，有zone1，zone2，zone3凝胶带，经分析zone1为α-酪蛋白，zone2为β酪蛋白，后期条带变窄，这是因为α-酪蛋白分解成αs1、αs2，以及迁移至条带下方而造成的；而zone 2和zone 3中肽类随着时间逐渐增多，而zone3以下的有低分子量的肽随着时间增多，该区带主要是乳酸菌中的蛋白酶或肽酶作用所致。观察20.1～30.0 ku中间的zone4电泳带，通过干酪D可以看出，在此位置电泳带90 d的要比75 d带深一些，说明在此位置小分子物质增加；干酪A在此位置出现一条带，而干酪B，C，D在此位置均有两条带；具体原因还需进一步研究。

图5 干酪B的SDS电泳结果

图6 在75d和90d的SDS电泳结果

3 结论与讨论

（1）随着成熟时间延长，并伴随着pH值先降低后升高的变化趋势，乳酸菌菌数也呈先下降后上升并保持稳定的状态。添加附属发酵剂的干酪能在成熟期内维持较高的活菌数。

（2）各实验组干酪的12%TCA可溶性氮含量随着成熟时间延长逐渐增加，在1个月后不同组别之间差异显著（P＜0.05），含有高自溶度附属发酵剂的干酪B非蛋白氮的含量最高，为8.00%，在对照干酪（未添加附属发酵剂）中的质量分数为7.35%。本文中添加的快速自溶的乳酸菌能加快蛋白质分解。

（3）通过电泳图很直观的看到随着成熟期延长，小分子物质增加，在zone3以下泳带颜色加深，低分子量的肽随着时间增多，该区带主要是乳酸菌中的蛋白酶或肽酶作用所致。

高自溶度附属发酵剂对干酪蛋白分解有促进作用，但效果不如直接添加促熟外源酶（如枯草芽孢杆菌蛋白酶）那样明显，且发酵剂所释放酶的组成和类型尚不清楚，需要进一步研究。若能确定该酶类型并改变添加发酵剂的方式，也许能快速缩短干酪成熟时间。

[1] GASSON M J.Lytic Systems in Lactic Acid Bacteria and Their Bacteriophages[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1996,70,147-159.

[2] LAW B A.Controlled and Accelerated Cheese Ripening:the Research Base for New Technologies[J].International Dairy Journal,2001,11:383-398.

[3] KUNJI E S,MIERAU J,HAGTING A,et al.The Proteolytic Systems of Lactic Acid Bacteria[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1996,70:187-221.

[4] LYNCH C M,MCSWEENEY P L H,FOX P F,et al.Manufacture of Cheddar Cheese with and without Adjunct Lactobacilli under Controlled Microbiological Condition[J]s.International Dairy Journal,1996,6:851-867

[5] HANNON J A,WILKINSON M G,DELAHUNTY CM,et al.Use of Autolytic Starter Systems to Accelerate the Ripening of Cheddar Cheese[J].International Dairy Journal,2003,13:313-323.

[6] KENNY O,FITZGERALD R J,CUINN G.O,et al.Autolysis of Selected Lactobacillus Helveticus Adjunct Strains during Cheddar Cheese Ripening[J].International Dairy Journal,2006,16:797-804.

[7] ISHII S.Study on the Kumiss(Airag)of Mongolian Nomads after Severe Cold in the Winters of 2000 and 2001[J].Milk Science,2003,52:49-52.

[8]董莹.不同体细胞原料乳对契达干酪品质的影响[D].内蒙古农业大学，2006.

[9] BYNUM D G,BARBANO D M.Whole Milk Reverse Osmosis Retentates or Cheddar Cheese Manufacture:Chemical Changes during Aging[J].Journal of Dairy Science,1985,68(1):1–10.

[10] CHRISTENSEN T,BECH A M,WERNER H.Methods for Crude Fractionation(Extraction and Precipitation)of Nitrogen Components in Cheese[J].International Dairy Federation Bulletin,1991,261:4-9.

[11] 郑小平.尿素-SDS-PAGE显示干酪成熟过程中酪蛋白降解生成的小分子肽[J].乳业科学与技术,2002,(99)2:7-8.

[12] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社,2004.

[13] FOX P F.Influence of Cheese Composition on Quality[J].International Agriculture research,1975,14:33-42.

[14] MCSWEENEY P L H,FOX P F,COGAN TIMOTHY M.Fundamentals of Cheese Science[M].Gaithersburg Maryland:Aspen Publishers，2000.

[15] MCSWEENEY P L H,FOX P F,LUCEY J A,et al.Contribution of the Indigenous Microflora to the Maturation of Cheddar Cheese[J].International Dairy Journal,1993,3(7):613-634.

Effect of autolytic starter adjuncts on proteolysis of Cheddar cheese

SUN Zhuo1，2,LV Jia-ping1,ZHANG Jia-cheng2,KONG Fan-pi1,LI Hong-juan1
（1.Institute of Agro-food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.college of food science and engineering，Qingdao agricultural university，Qingdao 266109，China）

To investigate the hypothesis,Cheddar cheese were made with or without starter adjuncts that had different autolysis rate of lactic acid bacteria.Cheddar cheeses were sampled to analysis the populations of lactic acid bacteria,the changes of cheese pH value,the proteolysis by determining pH4.6 soluble nitrogen,12%TCA soluble nitrogen and performing SDS-PAGE electrophoresis at different ripening time.The results showed that 12%TCA soluble nitrogen increased with ripening time,and which were significant different between different rows after one month(P＜0.05).The 12%TCA soluble nitrogen in the cheddar cheese with starter adjuncts that had high autolysis rate was 8.00%,which was higher compare to the control cheese that without starter adjuncts.As the SDS-PAGE electrophoresis showed,the protein was proteolysis at a certain degree with slight difference;the autolysis of lactic acid bacteria accelerated the rate of proteolysis.

autolysis;starter adjuncts;proteolysis

Q936

A

1001-2230（2010）12-0012-03

2010-09-25

国家“十一五”奶业科技支撑计划项目课题“乳品加工关键设备及材料研究与开发”（2006BAD04A07）。

孙卓（1987-），女，硕士研究生，研究方向为乳品科学与技术。

吕加平