应用SELDI-TOF-MS技术分析肝癌患者血清蛋白质谱的手术前后变化

王秀丽，高春芳，赵 光，马 波，李冬晖

原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在许多地区其发病率有逐年增高的趋势。对于具有典型临床表现者其诊断并不困难，但这时患者往往已界中晚期，预后不佳。因此原发性肝癌的早期诊断和治疗一直为临床和科研工作者所关注，而寻找具有高灵敏度和高特异性的原发性肝癌特异性肿瘤标志物则是原发性肝癌早期诊断的关键所在。笔者利用SELDI-TOF-MS（表面增强激光解析离子化飞行时间质谱）技术对肝癌患者手术前后血清蛋白质谱的变化进行分析对比，旨在筛选可用于原发性肝癌早期临床诊断和预后判断的特异性生物标志物。

1 资料和方法

1.1 研究对象 本组原发性肝癌患者（经影像检查或术后病理诊断确诊）47例，年龄36～71岁，平均56岁；男女比例为4.8∶1。正常健康人（对照组）81名为正常体检者，年龄30～70岁，平均50岁；男女比例为2.8∶1。所有患者术前及术后15 d清晨空腹无菌采静脉血2 ml，血清标本于-80℃冷冻保存。同时，对所有标本进行AFP（甲胎蛋白）测定分析。以上血清标本来源均为2007-10～2008-12在笔者所在医院住院及门诊患者，患者组与对照组均无引起血清中蛋白质含量发生变化的其它相关疾病。

1.2 试剂和仪器 尿素、 乙腈（acetonitrile，ACN）、三氟乙酸（trifluoro-acetic，TFA）、芥子酸（sinapinic acid，SPA）、三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（Tris-HCl）、3-环乙胺-1-丙磺酸（CHAPS）及羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）等均购自美国Sigma公司。SELDI蛋白质芯片系统（PBSⅡ-C）及其配套的金属亲 和 表 面 （immobilized metalaffinity capture,IMAC30）铜离子芯片均购自美国Ciphergen公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的准备 4℃融解血清，1 000 r/min离心10 min；取20μl血清，置于1.5 ml离心管中；加40 μl U9 缓冲液 （含 9 mol/L 尿素、2%CHAPS、50 mmol/L Tris-HCl，pH9.0）；4 ℃振荡 30 min， 使蛋白质变性；取20 μl变性后的样品，每管加入240 μl U1缓冲液 （U9缓冲液9倍稀释而成）；4℃振荡30 min。使最后上样的血清稀释约40倍。

1.3.2 芯片的预处理及与血清蛋白的结合 芯片每孔加100 mmol/L硫酸铜50 μl，室温下200×g振荡5 min，倾除硫酸铜；用去离子水冲洗5次后甩干，每孔中加入 100 mmol/L 醋酸钠（pH4.0）50 μl，室温下200×g振荡5 min；去离子水冲洗5次后芯片每孔加入结合／洗脱缓冲液 （含100 mmol/L磷酸钠、500 mmol/L 氯化钠，pH7.0）150 μl， 置于振荡器上，室温孵育5 min后除去缓冲液，重复1次，后每孔加入50 μl稀释好的血清样品，置于振荡器上，4℃孵育60 min后除去缓冲液；接着用150 μl结合/洗脱缓冲液冲洗2次，每次振荡5 min，最后1次用1 mmol/L HEPES(pH7.0)快速冲洗。取出芯片，待芯池即将风干时，加入饱和SPA（SPA1mg溶于15 μl 50%ACN、15 μl 1%TFA 中）2 次，0.5 μl/次。 风干后上机检测。

1.3.3 芯片检测与数据收集处理 ELDI蛋白芯片质谱仪在检测样品蛋白质指纹谱前用已知分子量的标准蛋白质芯片校正，使误差＜0.1%。检测时设定SELDI-TOF-MS的激光强度为175，灵敏度为8，收集数据的质荷比(M/Z)范围为2 000～20 000，收集位置20～80。用Ciphergen ProteinChip 3.2.0软件自动采集数据，用Biomarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质菏比（M/Z）数据进行处理，通过方差分析计算两组具有相同M/Z蛋白质峰波强度，并用P值表明其差异程度。

1.3.4 分类树鉴别诊断模型的建立 数据挖掘软件Biomarker Patterns Software 4.0对数据分组及相关性进行分析，建立用于肝癌诊断的最优决策分类树模型。

2 结 果

2.1 肝癌术前组与正常对照组血清样品蛋白质谱的分布结果 ①峰波检测 （Peak Detection）：设定47例肝癌患者术前血清样品与对照组81人血清样品检测的蛋白质分子量区间在1 500～20 000 Da，低于1 500 Da的蛋白质或肽段将自动从波谱中被清除，因在0～1 500 Da这一区间可存在加合物、试剂成分、SPA以及其它化学成分，影响后续的数据分析；利用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪对IMAC30芯片进行检测，所得到的蛋白质以波谱的形式表示；②波峰整合（Peak alignment）与蛋白质谱分析：采用Biomarker Wizard软件对所得波谱进行分析，术前组与正常对照组血清样品中大多数蛋白质峰的表达量都是基本相同的，但两组之间仍有32个蛋白质表达量具有一定判断差别，其中有28个蛋白质峰在术前组与正常组比较时有显著性差异 （P＜0.01），在这28个具有表达差异的蛋白质中，术前患者组血清中高表达量的蛋白质占5个，它们的平均分子量分别为4472.59、8 134.96、8 942.49、8 242.58、4 064.56 Da；与正常对照组相比较，蛋白表达量下调的有23个（表1）；③肝癌血清蛋白标志物的筛选及其模板的建立和分析：利用Biomarker Patterns软件对检测得到的数据进行数据挖掘，建立了由M/Z为9 294.93 Da这个蛋白质所组成的最优分类树模型（图1），可以正确地将肝癌患者与正常人分组；该模型中节点1为母节点，包括了所有用于建立模型的受检样本（128例）；节点处的判别函数（各系数与括号内相应蛋白质相对含量的积）为：在节点1处如M9 294.93≤4.993，归终节点1，否则为终节点；该模板诊断肝癌的敏感性为97.9%（46/47），特异性为97.5%（79/81）。

图1 肝癌组与对照组血清蛋白图谱分类树模型Node为结点；Terminal Node为终结点；N代表样本数，M代表蛋白质质荷比

表1 肝癌术前组和正常对照组血清质谱中差异蛋白的表达

2.2 肝癌患者术前与术后血清蛋白质谱的变化

在相同条件及参数下，应用IMAC30蛋白质芯片和Biomarker Wizard软件对肝癌术后患者血清分析，并与术前组和正常对照组的蛋白质谱进行对比研究。结果发现M/Z为5 909.79、5 930.91、6 116.71、7 574.51、8 134.96、5 972.61、4 064.55、11 727.26、5 342.65 Da的蛋白表达量在术后均明显下降，与正常对照组蛋白质峰强度相当，无显著性差异，与术前组比较具有非常显著性差异（P＜0.01），见表2。

3 讨 论

肝癌分为原发性肝癌及转移性肝癌。在原发性肝癌中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，常简称为肝癌）最为多见，约占95%，其次是胆管细胞癌（cholangiocarcinoma）。肝癌是全球第五位常见癌症，占所有癌症的5.6%，全球每年的新病症约为564 000例[1～3]。肝癌亦是我国癌症中的第二号杀手，全球50%以上的肝癌发生在我国。罹患肝癌的高危人群以35～65岁的中年人为主，尤其以男性患者较多，是女性的2～4倍。高达80%～90%的肝癌患者同时有肝硬化。慢性乙型、丙型肝炎病毒是其最主要的病因（约80%），其次是酒精、药物、摄食含有黄曲霉素的食物等[3～5]。全球80%～85%的肝癌与乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）感染有关，而 HBV阴性者中绝大多数有丙型肝炎病毒(HCV)的感染。约15%～40%的慢性HBV感染个体最终死于肝硬变和(或)肝癌[6]。上海复旦大学肝癌研究所对18 816例患者进行随机对照研究 （randomized controlled trial，RCT），对高危人群每 6个月监测甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）和腹部超声发现肝癌筛查有助于降低肝癌病死率37%[7]。但是AFP是一种敏感性与特异性较低的生物标记，而超声检查又过多依赖于操作者的工作经验[8]。同时，临床常用的AFP检测若出现阳性，绝大多数表明肝癌已经发生，其它血清学指标尚缺乏可靠性。肝癌发生的机理甚为复杂，至今发现的基因和蛋白质表达异常十分多见，但尚未据此形成更为可靠的预测措施[9]。

表2 47例肝癌患者手术前后血清质谱中差异蛋白的表达

血清蛋白质组的研究能获得大量的、完整的和动态的血清蛋白质谱。而每种疾病在症状出现之前及不同的发展阶段，都有其独特的蛋白质变化，分析这些早期发生的蛋白质变化，有望获得临床早期诊断的生物学标志物。笔者利用SELDI-TOF-MS技术，对47例原发性肝癌患者手术前后血清标本与81名正常体检血清样本分别进行对比分析，发现在肝癌组与正常对照组之间存在28个有显著差异的蛋白质峰，其中5个蛋白在肝癌组明显上调，23个下调；肝癌治疗前后存在显著差异的蛋白峰25个，均表现为明显下调。

将血清蛋白质谱建立数据库，利用Biomarker Wizard统计软件对数据库进行分析，以M/Z值为9 424.93 Da的蛋白质建立诊断模型可将正常人与肝癌患者准确的分组。实验结果表明，采用SELDITOF-MS质谱技术可以筛选出原发性肝癌与正常人群之间血清中表达有差异的特异性生物标志物，并且对肝癌患者预后判断分析具有重要临床意义。

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