反相高效液相色谱法测定复方硫酸氨基葡萄糖分散片的含量

初立梅，徐健峰，石 涛，徐康康

（1.南京医科大学附属南京儿童医院，江苏 南京 210008； 2.南京威尔曼药物研究所，江苏 南京 210009；3.东南大学医学院附属中大医院，江苏 南京 210009）

氨基葡萄糖被广泛地用于缓解骨关节病的症状，目前已上市的氨基葡萄糖类药品包括盐酸氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖氯化钾(钠)复盐和硫酸氨基葡萄糖。Elson-Morgan法是这类物质含量的经典检测法[1]，虽经数十年的改进[2-3]，但操作仍显烦琐。高效液相色谱（HPLC）法是近年来的研究热点。美国药典（USP30）采用示差检测法进行氨基葡萄糖的分析检测，但此方法对环境温度要求较严苛，操作具有一定的局限性。本研究采用柱前衍生化后，用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定硫酸氨基葡萄糖分散片的含量，旨在为氨基葡萄糖的含量测定提供更好的检测方法。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪，包括LC-10ATVP泵，岛津SPD-10AVP紫外检测器，7725i进样阀，HW色谱工作站；BP 211Dsartorius分析天平。盐酸氨基葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所）；硫酸软骨素对照品（Sigma公司）；复方硫酸氨基葡萄糖分散片（南京威尔曼药物研究所，批号为 20081213，20081215，20081217）；甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil C18柱 (50 mm ×4.6 mm，5!m)；流动相：三水合乙酸钠水溶液（6.80 g三水合乙酸钠，加入700 mL水使溶解，用醋酸调 pH 至 5.9，加水至 1 000 mL，摇匀）-甲醇（90∶10）；流速：1.0 mL/min;柱温：室温；检测波长：340 nm；进样量：20!L。在给定的色谱条件下，配制质量浓度为1 g/L的对照品溶液，按衍生化方法衍生后进样，记录色谱图(图1)。可见盐酸氨基葡萄糖的保留时间为4.728 min，分离度为7.136，拖尾因子为1.368，理论塔板数为3 857。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取经105℃干燥至恒重的盐酸氨基葡萄糖对照品适量，加水制成质量浓度为1 g/L的溶液，作为对照品溶液。取样品20片，研细，精密称取粉末适量（相当于盐酸氨基葡萄糖100 mg），置100 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，于快速混匀器上混匀使粉末悬浮，65℃水浴加热20 min，置磁力搅拌器上搅拌5 min，离心，取上清液作为供试品溶液。

2.3 衍生化方法

取0.2 mol/L的硼酸盐缓冲液400!L，置一小瓶中，加入100!L衍生化试剂和100!L对照品溶液或供试品溶液，混合，衍生化1 min后进样，记录色谱图。结果 !-异构体与 "-异构体的保留时间之比为1.6～1.7，!-异构体的出峰时间在4 min左右，故可以 !-异构体的峰面积计算盐酸氨基葡萄糖的标示含量。

2.4 方法学考察

干扰性试验：取处方量硫酸软骨素及空白辅料适量，照供试品溶液的制备方法操作，按衍生化方法衍生后进样，记录色谱图。结果硫酸软骨素及空白辅料对硫酸氨基葡萄糖的含量测定无干扰。

破坏试验：取批号为20081213的样品20片，研细，精密称取粉末适量，分别置100 mL量瓶中，分别加入1 mol/L盐酸溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液、30%双氧水各1 mL，另取处方量的空白辅料及硫酸软骨素同法操作，放置1 h后分别用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调pH至中性，照供试品溶液的制备方法操作，按衍生化方法衍生后进样。结果酸、碱、氧化破坏试验的图谱与未破坏的供试品溶液图谱相比，峰面积均减小，但无杂质峰，表明在此测定方法下主药的降解产物对含量测定无影响。

线性关系考察：精密称取经105℃干燥至恒重的盐酸氨基葡萄糖对照品298.65 mg，置100 mL量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀作为贮备液。精密量取贮备液 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为300，600，900，1 200，1 500!g/mL 的系列溶液。分别取 100!L 按衍生化方法衍生后进样，记录色谱图。以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程 A=167.28 C+33 147，r=0.999 7（n=5）。结果表明盐酸氨基葡萄糖质量浓度在300～1 500!g/mL范围内与峰面积线性关系良好。

回收率试验：按样品处方量精密称取硫酸氨基葡萄糖氯化钠复盐适量（标示量的80%，100%，120%），置100 mL量瓶中，分别加入处方量的硫酸软骨素及空白辅料，照供试品溶液的制备方法操作；另精密称取经105℃干燥至恒重的盐酸氨基葡萄糖对照品适量，加水制成质量浓度为1 g/L的溶液，作为对照品溶液。分别取对照品溶液及供试液品溶各100!L，按衍生化方法衍生后进样，记录色谱图，按外标法以"-异构体峰面积计算回收量及回收率。结果平均回收率为102.68%，RSD为1.08%(n=9)，表明方法的回收率良好。

进样精密度试验：取样品适量，研细，精密称取粉末适量（相当于盐酸氨基葡萄糖100 mg），置100 mL量瓶中，依法制备供试品溶液，按衍生化方法衍生后进样。结果峰面积的 RSD=0.46%（n=6），表明进样精密度良好。

中间精密度试验：按2005年版《中国药典（二部）》要求，取批号为081212的样品，由不同人员于不同日期在不同仪器上依法测定含量，测定结果与重现性试验前3份的结果一起计算。结果的RSD为0.67%，表明方法中间精密度良好。

重现性试验：精密称取同批样品6份，按供试品溶液的制备方法操作，按衍生化方法衍生后进样测定含量。结果平均含量为99.94%，RSD为0.54%（n=6），表明方法重现性良好。

稳定性试验：取重现性试验项下的第6份供试品溶液，室温下留样，分别于 0，2，4，6，8 h 时取 100!L，按衍生化方法衍生后进样。结果的 RSD为0.59%（n=5），表明供试品溶液在室温条件下8 h内稳定。

2.5 样品含量测定

取3批样品，按供试品溶液制备方法操作，按衍生化方法衍生后进样，记录色谱图，按外标法以"-异构体的峰面积计算标示含量。结果批号为20081213，20081215，20081217的3批样品中硫酸氨基葡萄糖的含量分别为100.9%，101.9%，101.0%。

3 讨论

硫酸氨基葡萄糖无特征吸收峰，紫外吸收在末端紫外区，在此波长下检测时对流动相、试剂纯度、仪器稳定性等要求较高。因此，在本试验中采用了衍生化方法。硫酸氨基葡萄糖是以氨基葡萄糖为母体和氯化钠形成的复盐，氨基葡萄糖与衍生化试剂邻苯二甲醛、3-巯丙酸可衍生化生成衍生物。该衍生物稳定，分子吸收系数大，在RP-HPLC系统中具有很好的色谱性质，且专属性强。

本研究建立了柱前衍生化法，采用RP-HPLC法测定复方硫酸氨基葡萄糖分散片的含量，方法可行，结果准确可靠，可用于该制剂的质量控制。

[1]Elson LA，Morgan WTJ.A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine[J].Biochem J，1933，27(6):1824-1828.

[2]Johnston JP，Ogston AG，Stanier JE.A modification of the elson and morgon method for the estimation of glucosamine[J].Analyst，1951，76:88-89.

[3]El-Saharty YS，Bary AA.High-performance liquid chromatographic determination of neutraceuticals，glucosamine sulphate and chitosan，in raw materials and dosage forms[J].Analytica Chimica Acta，2002，462(1):1 251.