人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化

沈 泓,易 喻,梅建凤,朱克寅,李 敏,应国清

(1.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014;2.杭州博林生物技术有限公司,浙江 杭州 310018)

人绒促性素(human chorionic gonadotrophin,hCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素。在妊娠早期hCG的浓度迅速增高,检测尿中的hCG即可证实妊娠[1]。有许多研究表明,在滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤病人的血和尿中有游离的hCG的β亚基存在[2]。因此,研制高纯度的hCG单克隆抗体对早孕、癌症的检测有重要的意义。传统的用得最多的纯化方法为盐析-辛酸沉淀法、疏水色谱[3]、离子交换[4]等。这些方法操作复杂,步骤繁琐,纯化效率不高,产率和纯度都很低。蛋白A亲和色谱是纯化抗体的一种重要的方法。A蛋白来源于金黄色葡萄球菌,有5个位点能够与IgG的Fc段结合,一个偶联在凝胶上的A蛋白分子至少能结合2个IgG分子。重组A蛋白可通过C端的半胱氨酸残基与琼脂糖凝胶单点偶合,增加了重组A蛋白与琼脂糖凝的结合量,因此大大提高了重组A蛋白-琼脂糖凝胶与抗体蛋白的结合能力[5-6]。这一特点使之非常适合用于纯化腹水中的单克隆抗体。但目前尚未见利用蛋白A亲和色谱方法纯化hCG单克隆抗体的报道。本研究以纯化的hCG为免疫原,利用经典的淋巴细胞融合技术,建立了稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对得到的单克隆抗体进行了纯化和鉴定,以期为后续的早孕、肿瘤相关研究提供实验基础。

1 材 料

1.1 动物、细胞株

BALB/c小鼠,浙江省动物实验中心,许可证:SCXK(浙2003-0001);F1小鼠,浙江中医药大学动物实验中心,许可证:SCXK(沪2007-0005);SP2/0骨髓瘤细胞,华安生物技术有限公司。

1.2 仪器

层流超净台SCV-4A1,Streamline Laboratory Products;三目倒置相差显微镜ELWD0.3T1-SNCP,Nikon;二氧化碳恒温培养箱3111,Thermo Electron Corporation;HiTrap rProtein A FF色谱柱(5mL)、AKTA purifier,GEHealthcare。

1.3 试剂

hCG(5 000 U/mg),ProSpec公司;HAT培养液,华安生物技术有限公司;PEG(相对分子质量5 000),Sigma公司;胎牛血清(BSA),民海生物工程有限公司;RPMI 1640培养液,吉诺生物医药技术有限公司;羊抗小鼠IgG-HRP,博士德生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 免疫动物

取8周龄的BALB/c小鼠,用hCG抗原皮下多点免疫,每次免疫量为100μg/只,第1次免疫与等量的弗氏完全佐剂充分乳化,第2,3次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化,每次间隔7d,融合前3 d腹腔直接注射抗原100μg加强免疫。

2.2 细胞融合

将小鼠处死,无菌摘取脾脏,研磨制取脾B淋巴细胞悬液,洗涤调整细胞浓度为1×107～5×107/mL备用。将免疫脾B淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按5∶1混合后离心弃上清,缓慢加入50%PEG溶液1mL,间隔1 min后,缓慢滴入无血清培养液,终止融合剂的作用,经洗涤去除融合剂后加入所需量的细胞培养液,分种于96孔培养板孔内,每孔100μL。

2.3 杂交瘤细胞的筛选

在接种96孔培养板时,每孔加入HAT培养液100μL,2～3 d换液1/2,经过2周的培养后,骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞即被选择培养出,然后进行单克隆化。

克隆化方法用有限稀释法,按实验室常规方法进行,一般克隆化3～4次,直至克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止。

2.4 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定

体内诱生法制备腹水,按实验室常规方法进行。间接ELISA测抗体效价。将hCG抗原1.25 U/孔包被酶标板,设置空白对照孔,37℃包被过夜;PBS-T(含有吐温20的磷酸盐缓冲液)浸洗3次,每孔加入封闭液(含1%BSA的PBS-T)200μL,37℃孵育2 h;PBS-T浸洗3次,每孔加入200μL待测样,以封闭液梯度稀释(10-1～10-8),37℃孵育1 h;PBS-T浸洗3次,每孔加入用封闭液按1∶3 000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP 100μL,37 ℃孵育 1 h;PBS-T浸洗3次,双蒸水浸洗3次,每孔加入邻苯二胺底物溶液100μL,置暗处反应5 min,阳性孔变为棕黄色,每孔加入2 mol/L H2SO4溶液100μL终止反应。

2.5 抗体的纯化

选择HiTrap rProtein A FF 5mL预装色谱柱纯化抗体。取适量腹水,10 000 r/min离心15 min,取上清,经过0.22μm微孔滤膜过滤后,用20 mmol/L磷酸缓冲液上样,用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液洗脱。考察选择上样缓冲液的pH值和离子强度、洗脱缓冲液的pH值,控制样品流速。

SDS-PAGE法鉴定单抗纯度。分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%,还原状态下处理样品,电泳后以考马斯亮蓝R250染色,然后经凝胶成像仪扫描鉴定纯度。

3 结 果

3.1 hCG杂交瘤细胞株的建立

3.1.1 小鼠血清抗体效价检测 hCG抗原免疫的BALB/c小鼠共6只,眼眶取血检测效价(表1)。6只小鼠的血清抗体效价都达到了10-7以上,免疫效果较好,可进行细胞融合。

表1 免疫小鼠血清抗体效价Tab.1 Antibody titers in the sera of themiceimmunized with hCG

3.1.2 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后铺3块96孔板,经HAT培养液筛选后,测出7个阳性孔,取上清效价最高(10-3)的两孔细胞株(1C1,2G12)单克隆化4次。从表2看出,第2～4次单克隆时,2株细胞的阳性率均为100%。杂交瘤细胞株经15周的培养后依旧能稳定分泌单克隆抗体。经液氮冻存复苏后仍能稳定分泌抗hCG抗体。

表2 2株杂交瘤细胞株单克隆化实验结果Tab.2 Result of hybridoma cell cloning of 2 hybridoma cells

3.2 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定

3.2.1 杂交瘤细胞上清蛋白含量及抗体效价的检测 细胞上清抗体效价达到了10-3以上(表3)。

3.2.2 腹水蛋白含量及抗体效价的检测 2株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白,且抗体效价均在10-7以上(表3)。

表3 细胞上清和腹水中的蛋白含量及抗体效价Tab.3 Protein concentration and antibody titer of cell culture supernate and obtained ascites

3.3 抗体的纯化

在上样缓冲液pH 6.5,7.0,7.5和8.0条件下,目的单抗基本保留在色谱介质上。在pH 7.0的上样条件下,洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少,回收率略高。

上样缓冲液的离子强度为4 mol/L以上时会产生盐析效应,影响抗体的稳定性。在0～3.0 mol/L NaCl的离子强度下,目的单抗均能较好地与色谱介质结合,在3.0 mol/LNaCl的离子强度下,洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少,回收率较高。

采用pH为3.0的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液进行洗脱时,洗脱峰为单一峰,而且峰形较好,洗脱较完全,回收率高。随着pH的增加,洗脱时间越长,洗脱也越不完全,抗体回收率降低。当pH为6时,无明显的洗脱峰。

样品在各个流速下进行上样和洗脱,都可以得到较高的纯度和回收率,流速对其影响较小。因此为了提高效率,可以采用5.0mL/min的流速进行上样和洗脱。

本实验确定pH 7.0,20 mmol/L磷酸缓冲液+3.0 mol/L NaCl为最佳上样条件;pH 3.0,0.1 mol/L柠檬酸为最佳洗脱条件。纯化后抗体纯度达98%以上,回收率达75%。色谱结果如图1所示。电泳鉴定结果如图2所示。

4 讨 论

本文采用hCG免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨艘瘤细胞SP2/0融合,经反复筛选和单克隆化后得到2株稳定分泌单克隆抗体细胞株。所获得的单克隆抗体细胞株为将来有关早孕、癌症检测、激素本身相关研究及疫苗研制等领域打下基础。

hCG与来自脑垂体的一些糖蛋白如促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和促甲状腺激素(TSH)等结构相似,α链的氨基酸排列顺序基本相同,而代表hCG特异性的仅是β链羧基末端约30个氨基酸的片段。故用完整的hCG分子作为免疫原制备单克隆抗体,或多或少地会和LH、FSH、TSH发生交叉反应,抗α-hCG的抗体无法识别α-hCG和甾体糖蛋白之间的差异[7]。因此我们设想下一步采用新型的基因免疫法来制备针对hCGβ亚基羧基末端 37肽(βhCG-CTP)的单克隆抗体,避免交叉反应。

随着单抗在诊断与治疗中应用的快速发展,对单抗的种类及数量的需求越来越多[8],同时也对相应的下游纯化技术提出更高的要求。纯化抗体的方法多种多样,硫酸铵沉淀法纯化后的纯度很有限;辛酸提取法的操作时间太长,效果也不是很理想;离子交换色谱和凝胶过滤法纯化效果不错,但是过程太繁琐;疏水色谱能够影响蛋白的活性,柱子的再生也比较困难。所以寻找具有高效、快速、纯度高的纯化方法是有重要意义的。

本文采用蛋白A亲和色谱纯化单抗,仅一次纯化即可得到良好的分离效果,获得纯度高,特异性强,生物活性好的单抗,而且这种方法操作简便,快速(通常在2 h即可完成纯化过程),重复性好,色谱柱可反复多次使用,为今后单抗用于基础研究及临床诊疗过程中的质量控制提供了保证。

[1]杨廷富.人绒毛膜促性腺激素的临床意义及检测进展[J].检验医学与临床,2007,4(10):976-978.

[2]Michael G,Gregory W,Annete G,etal.Genetic immunization with the free human chorionic gonadotrophinβsubunit elicit cytotoxic T lymphocyte responses and protectsagainst tumor formation in mice[J].Lab Invest,1997,76(7):859-871.

[3]Manzke O,Tesch H,Diehl V,etal.Single-step purification of bispecific monoclonal antibodies for immunotherapeutic useby hydrophobic interaction chromatography[J].J Immunol Methods,1997,208:65-73.

[4]谢竞,石明隽,张国忠,等.不同 pH值和盐浓度对柱色谱提取抗-D抗体的影响[J].中国生化药物杂志,2005,26(4):208-210.

[5]Mccue JT,Kemp G,Low D,etal.Evaluation of protein-A chromatography media[J].JChromatogr A,2003,989(1):139-153.

[6]Hahn R,Kazumichi S,Steindl F,etal.Comparison of protein A affinity sorbentsⅢ:Life time study[J].J Chromatogr A,2006,1102(1-2):224-231.

[7]Steven V C,Powell JE,Lee A C,etal.Antifertility effects from immunization of femalebaboons with C-terminal peptidesof human chorionic gnadotropin[J].Fertil Steril,1981,36:98-105.

[8]潘萌,孔蕴,陈畅.单克隆抗体药物的研究进展[J].中国生化药物杂志,2008,29(1):62-64.