水蛭多肽对局灶大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用

王 希,武建卓,宋淑亮,王允山,梁 浩,吉爱国,

(1.山东大学 威海国际生物技术研发中心,山东 威海 264209;2.山东大学 药学院,山东 济南 250012)

水蛭为传统的破血化瘀药。新鲜水蛭的唾腺分泌物中含有抗凝血物质—水蛭素[1],而经干燥后的药材,水蛭素则被破坏[2],即失去了生物活性。然而,在实际应用中,水蛭是以干燥全体入药[3],却仍然具有破血、通经的功用。说明水蛭中除含有水蛭素外,还有其它的抗凝血成分。另一方面,水蛭因抗凝效果确切,临床应用较多,但其有效成分不明确,尚没有很好的定量方法。本实验从中药干药材日本医蛭(hirudo)中分离纯化出相对分子质量(M r)为500～1 000的多肽,并采用大鼠大脑中动脉栓塞性脑缺血再灌注损伤模型,观察水蛭提取物对局灶性脑缺血大鼠脑梗死面积、脑组织含水量改变、脑组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)含量等的影响,探讨其抗脑缺血损伤的作用机制,为进一步研究提供实验依据。

1 材 料

血塞通注射液(批号:20080702),黑龙江省珍宝岛制药有限公司哈尔滨分公司;水蛭多肽(Mr500～1 000),自制;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC),美国Sigma公司;SOD、MDA测定试剂盒,均由南京建成生物工程研究所生产,批号:20090504。

健康成年雄性Wistar大鼠(SPF级)180只,体重250～330 g,山东大学实验动物中心提供,动物合格证号为:SCXK(鲁)20030004。

eppendorf centrifuge 5810R低温离心机;8453E紫外分光光度计,美国Agilent;T18 basic高速匀浆机,德国IKA。

2 方 法

2.1 动物分组

Wistar大鼠随机分成6组:假手术组、缺血再灌注损伤模型组、血塞通(40mg/kg)阳性对照组、水蛭多肽(80mg/kg)高剂量组,水蛭多肽(40mg/kg)中剂量组和水蛭多肽(20mg/kg)低剂量组[4]。

2.2 给药方法

模型制备成功即刻腹腔注射给药,12 h后再次给药。

2.3 动物模型的制备

参照文献[5],大鼠用10%水合氯醛(350mL/kg,ip)麻醉,仰卧于手术台上,颈正中切开,分离左侧颈总动脉(CCA),颈外动脉(ECA),颈内动脉(ICA),用0号线结扎并剪断ECA的分支,分离ICA的颅外分支翼突腭动脉。夹闭CCA、ICA,将准备好的尼龙栓自ECA插入,经CCA分叉处通过ICA入颅至大脑前动脉(ACA),尼龙线插入深度约为18 mm。再灌注时外拉尼龙线使其球端回至ECA内即可恢复大脑中动脉的血供。假手术组除不插尼龙线外其余步骤相同。

2.4 神经功能评分

待大鼠清醒后,按Zea-Longa 5分制法[5]对各组试验大鼠进行神经功能评分(neurological scores)。0分:无明显神经功能缺损;1分:不能伸展左侧前肢;2分:行走时向左侧旋转;3分:行走时向左侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。

2.5 脑组织含水量的测定

缺血再灌注24 h后,每组取10只,断头取脑,去除脑干,称湿重;106℃烘干至恒重,得干重。计算脑含水量。

2.6 梗死面积的测定

大鼠缺血再灌注24 h后,每组取10只,断头取脑,除去小脑和低位脑干、嗅球。将脑沿冠状面切成厚度相同的6片,脑片置于质量分数为1%的TTC溶液10mL中37℃避光染色30 min。正常组织呈红色,梗死组织呈白色,数码相机正反面拍照,利用Image-pro plus 6.0分析6个脑片的梗死面积占脑片总面积的百分比。

2.7 脑组织匀浆和生化指标的测定

缺血再灌注24 h后,每组取10只大鼠,10%水合氯醛(350mg/kg,ip)麻醉后断头取脑,立即于冰上取出损伤侧大脑,去除嗅球、小脑和低位脑干,称重,按质量体积比1∶9加入4℃生理盐水,冰浴下15 000 r/min匀浆3 min,制成10%脑组织匀浆液,4℃,3 500 r/min离心10min,取上清液。按试剂盒说明,比色法测定每1 g脑组织中SOD的活性及MDA含量;考马斯亮兰法测定脑组织蛋白含量。

应用SPSS15.0统计软件进行数据处理分析,实验数据均用±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析检验,两组间比较采用t检验。

3 结 果

3.1 大鼠神经行为学

假手术组动物无神经功能缺损,模型组、血塞通和水蛭多肽给药组均有不同程度的神经功能缺损。其中水蛭多肽高剂量组和中剂量组统计学差别明显(P＜0.01和P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠神经功能评分(±s,n=10)Tab.1 Neurological scores(±s,n=10)

表1 大鼠神经功能评分(±s,n=10)Tab.1 Neurological scores(±s,n=10)

与缺血再灌注损伤模型组相比较:1P＜0.01,2 P＜0.051P＜0.01,2 P＜0.05 vs focal cerebral ischemic reperfusion injury group

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3.2 水蛭多肽对脑组织含水量、梗死面积的影响

与模型组相比较,水蛭多肽中剂量组脑含水量显著降低(P＜0.05);水蛭多肽高剂量组脑含水量明显降低(P＜0.01)。结果表明水蛭多肽降低脑含水量,缓解中风过程的脑水肿,且存在一定的量效关系。假手术组脑组织TTC染色呈均匀的玫瑰红色,模型组大鼠可见白色的梗死区,与假手术相比较明显增高(P＜0.01)。阳性药可降低缺血梗死面积(P＜0.01),与模型组相比较,水蛭多肽高剂量组梗死面积差异性显著(P＜0.05)。见表2。

3.3 水蛭多肽对脑组织SOD活性和MDA含量的影响

缺血再灌注后模型组的SOD活性显著下降,与假手术组有显著差异(P＜0.01),表明缺血再灌注后脑组织SOD活性受到很大影响,水蛭多肽高剂量组能明显升高脑组织中活性,与模型组相比差异有显著性(P＜0.05);缺血再灌注后模型组MDA含量显著高于模型组(P＜0.01),表明缺血再灌注后脑组织脂质过氧化反应强烈,伴有脑组织自由基聚集以及抗氧化酶活性的降低,水蛭多肽中、高剂量组能明显降低MDA含量,与模型组相比差异有显著性(P＜0.05)。见表2。

表2 水蛭多肽对大鼠缺血性中风脑组织含水量、梗死体积、SOD活性和MDA含量的影响(±s,n=10)Tab.2 Effects of low molecular weight Hirudo peptideson infarction area,water content of brains,superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)level in rats focal cerebral ischemic reperfusion injury(±s,n=10)

表2 水蛭多肽对大鼠缺血性中风脑组织含水量、梗死体积、SOD活性和MDA含量的影响(±s,n=10)Tab.2 Effects of low molecular weight Hirudo peptideson infarction area,water content of brains,superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)level in rats focal cerebral ischemic reperfusion injury(±s,n=10)

与缺血再灌注损伤模型组相比较:1P＜0.01,2P＜0.051P＜0.01,2 P＜0.05 vsfocal cerebral ischemic reperfusion injury group

4 讨 论

在急性脑血管病中,缺血性脑血管疾病占50%～70%[6],近年来发现发病后48 h内,绝大多数病人的缺血皮质已发生了再灌注。众所周知,脑缺血后的再灌注是神经功能恢复的基本条件,也是脑组织损伤加重的重要因素。本研究应用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型来观察水蛭多肽对脑缺血再灌注损伤的保护作用,结果证明,水蛭多肽能明显减轻脑水肿、缩小梗死面积和改善运动功能,显示出良好的脑缺血保护作用。但其机制可能与丹皮酚的脑保护作用机制不同,丹皮酚是通过降低脑缺血区组织黏附分子表达实现的[7]。而水蛭多肽是通过降低MDA含量、提高SOD活力,减轻自由基反应对脑组织的损害,对缺血脑组织发挥保护作用。水蛭多肽对脑缺血再灌注损伤保护作用的详细机制尚待后续研究探索。

[1]Huang Z H.A new anti-coagulation and antiplatelet aggregation drug:recombinant hirudin[J].Chin J New Drugs Clin Rem,2003,22(5):309-312.

[2]李艳玲,黄荣清,孙晓东.水蛭不同提取物抗凝活性的体外实验研究[J].中药材,2004,27(2):123-125.

[3]李时珍.本草纲目[M].下册.北京:人民卫生出版社,1982∶84-86.

[4]苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京:中国中医药出版社,1997:144.

[5]Longa E Z,Weinstein P R,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[6]张林峰,杨军,武阳丰,等.我国人群中缺血性和出血性脑卒中发病的相对比例[J].中华内科杂志,2003,42(2):94-97.

[7]张硕,高海青,张岫美.丹皮酚抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤脑组织细胞间黏附分子-1和血管细胞黏附分子-1的表达[J].中国生化药物杂志,2008,29(1):5-8.