MS-275增强顺铂致肝癌细胞凋亡效应的实验研究

张海元，许光华，张 静

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

MS-275增强顺铂致肝癌细胞凋亡效应的实验研究

张海元，许光华，张 静

(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

目的：探讨MS-275与化疗药物顺铂(cisplatin,DDP)联合应用对肝癌细胞系HLE增殖的抑制效果。方法：通过MS-275联合化疗药物顺铂处理培养的肝癌细胞系HLE，体外细胞毒性实验(MTT)法检测细胞增殖抑制率，流式细胞术(FCM)检测细胞周期和凋亡率。结果：MTT结果显示：0.5μmol/L MS-275与6.25μg/ml DDP联合应用后5d，HLE细胞增殖抑制率达(97.86±5.62)%，明显高于单用MS-275组的(51.75±2.31)%和DDP组的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)。流式细胞术结果显示：MS-275与DDP联合应用明显导致细胞S期减少，G2/M期阻滞；MS-275联合DDP组细胞凋亡率为(17.46±2.57)%，明显高于单用MS-275组的(7.62±0.59)%和DDP组的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)。结论：MS-275与DDP联合应用能显著提高对肝癌细胞系HLE增殖的抑制作用。

肝癌；细胞系；MS-275；顺铂；基因治疗

顺铂(cisplatin，DDP)是临床应用最为广泛的一种抗肿瘤药物。铂类药物的主要作用机制是通过损伤DNA, 使细胞进入G1期生长抑制，并诱导损伤严重的细胞进入凋亡状态[1]。但顺铂副作用较大，顺铂用量增大容易引起骨髓抑制及肾功能严重损害，另外顺铂使用剂量趋近于亚致死剂量时易引起耐药性，故使得顺铂应用于肝细胞癌的治疗效果并不理想。MS-275属于苯甲酰胺类HDACs抑制剂，可上调p21基因的表达，对多个小鼠的人肿瘤模型都表现出强烈的抑瘤作用[2]，但将MS-275和化疗药物顺铂联合应用于肝癌细胞国内外尚无报道。本实验拟采用低剂量的顺铂和MS-275联合应用，以探讨其是否具有协同作用，从而减少肝癌患者顺铂的使用剂量，减少顺铂的毒副作用，增强患者的耐受性。通过本项目中MS-275与顺铂联合应用对肝癌细胞系HLE影响的效果及机制的探讨，有望获得全新的联合抗肝癌的药物治疗方案。

1 材料与方法

1.1材料肝癌细胞系HLE由新加坡国立大学肿瘤研究所馈赠，细胞接种于含10%新鲜牛血清和抗生素的RPMI1640培养基中传代培养，RPMI1640培养液及二甲亚砜(DMSO)购自美国GIBCO公司。DDP购于锦州九泰药业公司,MS-275购自德国Merck公司。

1.2方法

1.2.1 HLE细胞培养 将肝癌细胞系HLE接种于含10%新生牛血清和抗生素的RPMI1640培养基中，置于5% CO2及饱和湿度的37℃培养箱中培养。利用0.125%的胰蛋白酶消化传代，1～2d换液一次。

1.2.2 体外细胞毒性实验法(MTT)检测肝癌细胞系HLE的增殖情况 将细胞接种于96孔板，设对照组、MS-275(0.5μmol/L)组、DDP(6.25μg/ml)组及MS-275+DDP联合治疗组，每孔加入MTT液20μl，于37℃ CO2培养箱培养4h，弃培养液，各孔加200μl二甲基亚枫，用酶联仪在570nm波长下检测每孔的光密度(D)，每组重复3板，计算细胞生长抑制率。

细胞生长抑制率(%)=[(1-实验组D值)/对照组D值]×100%。

1.2.3 流式细胞术(FCM)检测肝癌细胞系HLE的细胞周期和细胞凋亡情况 HLE细胞经单纯加入

DDP(6.25μg/ml)或MS-275(0.5μmol/L)及MS-275与DDP联合应用,48h后收集所有贴壁和悬浮细胞，用10mmol/L PBS(pH7.4)洗涤两次，通过流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡情况。

2 结 果

2.1各组药物对肝癌细胞系HLE的生长抑制率检测结果显示，0.5μmol/L MS-275与6.25μg/ml DDP联合应用120h后，HLE细胞增殖抑制率达(97.86±5.62)%，明显高于仅用MS-275组的(51.75±2.31)%及DDP组的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)。见表1。

表1 各组药物对HLE细胞增殖的抑制作用 %

注：MS-275+DDP组与MS-275组或DDP组比较，均Plt;0.05。

2.2流式细胞术检测HLE细胞周期和细胞凋亡率0.5μmol/L MS-275可导致HLE细胞S期减少、G2/M期阻滞，而MS-275与6.25μg/ml DDP联用后，对HLE细胞的S期减少、G2/M期阻滞更明显。当0.5μmol/L MS-275与6.25μg/ml DDP联用60h后，HLE细胞凋亡率达(17.46±2.57)%，明显高于单用MS-275组的(7.62±0.59)%和DDP组的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)。见表2。

表2各组药物对HLE细胞周期及凋亡的影响%

组 别G0/G1SG2/M凋亡率对照组5131±2893285±2471052±147091±026MS⁃275组6138±2551336±0871928±135762±059DDP组6278±3632139±175951±166736±047MS⁃275+DDP组5642±351483±2713142±2541746±257

注：MS-275+DDP组与MS-275组或DDP组比较，均Plt;0.05。

3 讨 论

肝细胞癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发生是一个多因素、多阶段、多基因变异的积累过程。肝细胞癌的发生、发展不仅存在细胞增殖与分化的异常，也与细胞凋亡异常、Runx3 基因启动子区域异常甲基化密切相关[3-4]。MS-275是一种较新的苯酰胺类组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDACIs)，有诱导肿瘤细胞增殖阻滞、分化和凋亡以及选择性地作用于肿瘤细胞等抗癌活性。据报道[5-6]，MS-275已被证实对白血病和实体瘤表现出良好的疗效，不良反应的发生率极低，发生程度亦较轻，说明与传统的化疗药物相比，MS-275具有较大的优势。本课题组在前期的实验中证明MS-275在肝癌细胞系Hep3B中能诱导p21WAF1/CIP1表达，加速肿瘤细胞凋亡[7]，并对多个小鼠的人肿瘤模型上都表现出强烈的抑瘤作用。Sato等[8]应用MS-275联合顺铂治疗口腔鳞状细胞癌，证实两类药物可通过不同途径作用于肿瘤细胞，具有协同作用，对化疗药物起到减毒增效的功效。

本实验通过MTT和FCM检测到了MS-275与化疗药物DDP单用或联合应用时对肝癌细胞系HLE增殖的抑制作用。MTT检查结果显示，0.5μmol/L MS-275与6.25μg/ml DDP联合应用后5d，HLE细胞增殖抑制率达(97.86±5.62)%，显著高于单用MS-275组的(51.75±2.31)%和DDP组的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)，说明苯酰胺类组蛋白去乙酰酶抑制剂MS-275与低剂量化疗药物顺铂联合应用后，能明显诱导肝癌细胞增殖抑制。FCM结果显示，MS-275与DDP联合应用明显导致细胞S期减少，G2/M期阻滞；MS-275联合DDP组细胞凋亡率为(17.46±2.57)%，显著高于单用MS-275组的(7.62±0.59)%和DDP组的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)，说明MS-275与顺铂联合应用，可能通过上调p21基因表达，阻止肿瘤细胞进入S期，使其停滞于G1期，同时发生G2/M期阻滞，肿瘤细胞凋亡率明显增强。由本实验结果推测，MS-275与DDP联合应用时其抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与细胞周期阻滞及上调凋亡作用有关。因此，MS-275与化疗药物DDP在肝细胞癌的治疗上有一定的互补作用，能提高肝细胞癌的疗效，并通过降低化疗药物的用量，从而减少其毒副作用及耐药性。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)类药物和化疗药物合用已经成为最近肿瘤治疗界的研究热点，该研究的方向是通过HDACIs类药物增加肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性起到增效的目的。通过本实验发现MS-275与顺铂联合应用明显优于单独用药组，其作用机制除了通过增强促进HLE细胞周期阻滞和凋亡作用外，可能还与HDACIs类药物本身特性有关。HDACIs类药物能导致组蛋白乙酰化，使染色质处在一种开放的构象上，会促使顺铂等以DNA为作用靶点的化疗药物更易接近核小体之间的DNA连接区，从而更易发挥作用[9]。本实验联合应用MS-275及化疗药物顺铂处理肝癌细胞，为肝细胞癌的治疗提供了新的靶点和全新的联合用药方案。

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[编辑] 一 凡

2010-08-29

大学生创新性实验项目(国家级)(091048930)

张海元(1974-)，男，湖北鄂州人，讲师，硕士，从事肿瘤分子生物学教学与研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.04.001

R735.7

A

1673-1409(2010)04-R001-03