靶向奶牛Lepr基因的miR-30d报告基因载体构建及靶向验证

门晶，接晶，高学军，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

靶向奶牛Lepr基因的miR-30d报告基因载体构建及靶向验证

门晶，接晶，高学军，李庆章

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

构建靶向奶牛Lepr基因的miR-30d荧光素酶报告基因载体，验证奶牛乳腺中瘦素受体基因（Lepr）是否为miR-30d的生物学靶基因。将microRNA荧光素酶表达报告载体特异性改造，使其含有TargetScan预测的与miR-30d靶向结合的奶牛Lepr基因序列，对miR-30d与重组荧光素酶载体质粒共转染后的细胞裂解液进行荧光素酶活性检测分析。结果表明，靶向奶牛Lepr基因的miR-30d荧光素酶表达报告载体构建成功，奶牛Lepr基因是miR-30d的靶基因，旨为miR-30d与Lepr基因的相互作用及与此基因相关的乳腺生物网络调控研究奠定实验基础。

Lepr；miR-30d；报告基因

0 引言

MicroRNA（miRNA）是一类参与基因转录后调控的内源性非编码小RNA[1，2]，其通过对靶mRNA的切割或翻译抑制来下调目的基因表达[3]。瘦素受体（LEPR）是一种跨膜受体，通过Lepr基因的信号转导影响着机体的多种生理过程[4，5]，并在哺乳动物乳腺发育、泌乳及退化过程中起着十分重要的作用[6-9]。本研究以荷斯坦奶牛乳腺Lepr这一泌乳相关重要功能调控基因与miR-30d靶向结合作用为切入点，通过构建miRNA荧光素酶报告基因载体对TargetScan中预测的miR-30 d的拟靶基因Lepr进行验证，旨在为奶牛乳腺发育与泌乳调控提供必要的研究手段和奠定重要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

Trizol、Lipofectamine2000（Invitrogen），ExTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶SpeⅠ、HindⅢ、DNA分子量标准及T4-DNA连接酶（TaKaRa），质粒小量制备与纯化试剂盒、PCR产物回收纯化试剂盒（Axgene），miR-30d表达质粒（GenePharma），Dual-LuciferaseReporter Assay Systerm（Promega），含Amp抗性的LB液体和固体培养基，氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂为国产分析纯。

1.1.2 载体与感受态细胞

pMDTM18-T载体、JM109感受态细胞（TaKaRa），pMIR-REPORT Luciferase miRNA Expression Reporter Vector（Ambion）。

1.1.3 组织材料与细胞

本实验室冻存的处于正常生理状态的荷斯坦奶牛乳腺组织和乳腺上皮细胞（荷斯坦奶牛购自黑龙江省畜牧业科技园区）。

1.2 方法

1.2.1 靶基因预测与引物设计

运用生物信息学方法进行预测，在TargetScan中，检索牛（Bta）这一物种中Lepr是否为miR-30 d的生物信息学预测靶基因。根据预测，针对Bta-miR-30 d中编码Lepr基因mRNA的3’UTR中包含有上述靶向结合位点的185 bp目标序列进行引物设计，并在引物中引入SpeⅠ和HindⅢ两酶切位点及其各自酶切位点的保护碱基，引物由上海英俊公司负责合成。

1.2.2 总RNA的提取与逆转录

取出液氮中预先冻存的荷斯坦奶牛乳腺组织，采用液氮研磨法并按照Invitrogen Trizol RNA提取说明书中的操作步骤进行总RNA的提取。选用所提取的总RNA完整度较好且质量较高的样品进行逆转录反应。

1.2.3 PCR扩增与产物纯化

以逆转录得到的cDNA为模板按照PCR反应体系与条件进行目的片段的扩增。产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析验证，目的带与分子量标准比对后按照胶回收试剂盒操作步骤将目的片段纯化回收。

1.2.4 T载体的重组与测序

纯化回收的PCR产物与pMDTM18-T载体连接，然后将其转化至JM109感受态细胞扩增。挑选阳性克隆37℃过夜培养，得到的菌液按照质粒提取试剂盒的操作步骤提取重组T载体质粒。以该重组质粒为模板用PCR与电泳结合的方法初步鉴定，目的带与分子量标准比对符合理论值185 bp后交TaKaRa公司测序。

1.2.5 基因载体的重组与测序

根据引物引入的酶切位点对连有目的片段的T载体用SpeⅠ和HindⅢ进行37℃过夜双酶切，纯化回收与miR-30d靶向结合并带有相应粘性末端的目的DNA片段。利用SpeⅠ与HindⅢ将自身带有这两种酶切位点的pMIR-REPORT miRNA荧光素酶表达报告载体质粒37℃过夜双酶切，将开环质粒纯化回收。T4-DNA连接酶连接目的DNA片段与开环质粒，然后将重组质粒转入JM109感受态细胞扩增。挑选阳性克隆进行37℃过夜培养后，按照质粒提取试剂盒的操作提取重组载体质粒。以该重组质粒DNA为模板，经PCR与电泳结合的方法初步鉴定后交TaKaRa公司测序。

1.2.6 细胞培养

复苏本实验室冻存的荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞，用体积分数为15%的胎牛血清和1倍双抗的DMEMF-12培养液于37℃的CO2培养箱中进行培养与传代。

1.2.7 细胞的瞬时转染

转染前1 d选用1瓶约90%贴壁且生长状态良好的细胞接种于24孔板中，每孔细胞密度约为1×105个，每孔加入500 μL不含双抗的15%胎牛血清的DMEMF-12培养液过夜培养。转染时每孔细胞贴壁达80%以上，以靶向奶牛Lepr基因的miR-30 d重组质粒载体作为对照，每孔都转入10 ng质粒载体pRL-TK作为标准内对照来校正各组之间的差异，具体实验分组如下（表1）所示。转染时重组质粒载体与miR-30d表达质粒的加入量约为每孔100 ng和500 ng，转入质粒与转染试剂的加入量比为1∶3，具体操作根据Lipofectamine 2000说明书进行。细胞转染后6 h更换新鲜的培养液，转染48 h后收集转染细胞用于荧光素酶活性的检测。

表1 细胞转染实验分组

1.2.8 荧光素酶活性检测

转染48 h后按照Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒的操作进行荧光素酶活性检测。弃去待测细胞的培养液，PBS清洗细胞两次，残留液体吸出后加入被动裂解液PLB裂解细胞15 min，收集获得待测细胞裂解液。向测量管中加入20 μL细胞裂解液和100 μL的LARⅡ，测量得到荧光值1，再向测量管中加入100 μl的Stop&Glo试剂，测得荧光值2。值1比值2即得到相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1 基因载体构建结果

TargetScan中，在牛（Bta）这一物种中Lepr是否为miR-30d的生物信息学预测靶基因的具体预测结果及靶向结合位点如图1所示。

根据奶牛Lepr的3’UTR与miR-30 d特异性结合的位点设计出185 bp目的片段的PCR引物，该引物带有SpeⅠ和HindⅢ两酶切位点及其各自保护碱基，序列如下：

冻存的奶牛乳腺组织中提取的RNA完整性较好、质量较高，可以用于逆转录反应获得cDNA模板（图2）。利用已获得的cDNA模板与引物通过PCR得到大小为185 bp的目的片段（图3），纯化回收后与pMDTM18-T载体连接，感受态扩增后纯化回收，PCR法验证回收产物（图4）。初步验证符合理论值185 bp后，将重组T载体质粒送出测序，测序结果正确（图5），证明实验已获得含miR-30d靶向结合位点的奶牛Lepr的3’UTR序列的T载体重组质粒。

图3中，1为DL2000 DNA分子量标准，2和3为185bp的目的片段。

图4中，1为DL2000 DNA分子量标准，2为185bp的目的片段和重组T载体质粒。

将回收得到的带有相同粘端的185 bp目的片段和开环miRNA荧光素酶表达报告载体质粒连接，重组荧光素酶表达报告载体质粒经感受态扩增且纯化回收后测序，测序结果正确（图6），证明靶向奶牛Lepr基因的miR-30d荧光素酶报告基因载体构建成功。

图6 重组荧光素酶表达报告载体质粒测序结果

2.2 荧光素酶活性检测结果

通过对本实验室冻存的荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的复苏与传代培养，获得了可供转染实验的生长状态良好的细胞（图7）。

图7 奶牛乳腺上皮细胞（200×）

用双荧光素酶报告系统检测转染后细胞的裂解液荧光素酶的活性，利用SPSS 13.0 Duncan法对活性值进行统计分析。与重组质粒载体对照组相比，共转染miR-30 d荧光表达质粒组使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）（图8），可以说明TargetScan预测结果正确，奶牛Lepr是miR-30d的靶基因。

图8 相对荧光素酶活性检测

图8中，A组为荧光素酶重组质粒载体，B组为荧光素酶重组质粒载体+miR-30d，C组为荧光素酶重组质粒载体+miR-139，同列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

3 讨论

miRNA广泛存在于动物、植物、一些病毒甚至藻类中，是小分子非编码RNA家族的重要成员之一。miRNA通过对靶mRNA切割或翻译的抑制来下调目的基因的表达，诸多研究表明miRNA在生长发育、增殖分化、病毒感染和肿瘤发生等多种生物学事件中扮演重要角色，准确地对靶基因进行预测是研究miRNA作用机制和其生物学功能的必备前提[10]。第一个miRNA及其靶基因是1993年通过分离和克隆细胞内小分子RNA的方法鉴定的，但此方法灵敏度很低。随着生物信息学的发展，miRNA靶基因的生物信息学预测在miRNA靶基因的预测中起到了积极的作用，许多种靶基因预测软件应运而生。本研究选取奶牛乳腺发育和泌乳相关重要功能调控基因Lepr为靶标基因，根据miRNA靶基因预测常用软件TargetScan对在牛这一物种中与Lepr靶向互补结合的miRNA进行预测。预测结果表明miR-30 d与Lepr的匹配位点单一且匹配度较高，故以miR-30 d与Lepr的靶向相互作用为切入点展开研究。

报告基因是指表达产物易被检测且能够与内源性蛋白相区别的基因。报告基因应用广泛、种类繁多。随着报告基因技术的发展，荧光素酶、绿色荧光蛋白等在检测组织和细胞基因表达、研究疾病发生机理及基因靶向治疗的分子机制等方面发挥了重要作用。常见的报告基因有β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌性碱性磷酸酶等[11]，但荧光素酶报告基因载体系统是目前miRNA靶基因验证的常用方法，该方法具有操作简便、灵敏度高的优点。

本研究通过对奶牛乳腺总RNA的提取与逆转录，将miR-30 d与其预测靶基因奶牛Lepr基因3’UTR结合位点在内的185 bp序列进行引物设计并PCR扩增。验证并纯化扩增产物后将其插入荧光素酶编码区下游，成功构了建荧光素酶报告基因载体。将构建好的报告基因载体质粒转染及与miR-30 d共转染细胞后进行荧光活性变化检测，并对荧光活性数值进行统计学分析。结果表明：荧光素酶载体质粒转染组与荧光素酶载体质粒和miR-30 d共转染组相比，荧光活性值显著降低（P＜0.05），证明了Lepr是miR-30 d的靶基因，为进一步研究miR-30 d对Lepr基因表达及相关生物网络转录后的水平调控提供了实验分析手段。

[1]BARTEL D P.MicroRNA:Genomics,Biogenesis,Mechamism,and Function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

[2]FILIPOWICZ W,BHATTACHARYYA S N,SONENBERG N. Mechanisms of Post-Transcriptional Regulation by MicroRNAs:Are the Answer Insight[J].Nat Rev Genet,2008,9(2):102-114.

[3]Lewis B P,Burge C B,Bartel D P.Conserved Seed Pairing,often Flanked by Adenosines,Indicates that Thousands of Human Genes Are MicroRNA Targets.Cell,2005,120(1):15-20.

[4]李强.瘦素、瘦素受体及其信号转导[J].第二军医大学学报,2007,28 (7):752-755.

[5]BURGUERA B,COUCE M E,LONG J,et al.The Long Form of the Leptin Receptor(OB-Rb)is Widely Expressed in the Human Brain[J].Neuroendocrinology,2000,71(3):187-195.

[6]李萌,李庆章.奶山羊乳腺中瘦素的信号转导通路[J].中国乳品业, 2008,36(10):23-25.

[7]林叶,李庆章.小鼠乳腺中瘦素的信号转导通路[J].东北农业大学学报,2006,37(1):58-63.

[8]林叶,李庆章.小鼠乳腺中瘦素及其受体的表达与作用[J].生命科学,2007,37(4):441-446.

[9]李萌,李庆章.奶山羊乳腺中瘦素及其受体的表达与作用[J].中国农业科学,2008,41(12):4187-4193.

[10]ZAMORE P D,HALEY B.Ribo-gnome:the Big World of Small RNAs[J].Science,2005,309(5740):1519-1524.

[11]Naylor L H.1999.Reporter Gene Technology:the Future Looks Bright[J].Biochem Pharmacol.58:749-757.

Construction of dairy cow Lepr targeting miR-30d reporter gene vector and verification of its targeting

MEN Jing,JIE Jing,GAO Xue-jun,LI Qing-zhang
(The Key Dairy Science Laboratory of Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To establish luciferase reporter vector of dairy cowLeprtargeting miR-30d,and identify ifLepris a target gene of miR-30d in dairy cow mammary gland.The luciferase expression reporter vector was rebuilt with the sequence whichLeprcould combine with miR-30d.The cells which miR-30d and the rebuilt vector were cotransfected in were fragmentated and the luciferase activity was detected.The luciferase expression reporter vector is constructured successfully,Lepris a target gene of miR-30d.This study establishes the experimental foundation for both the interaction between miR-30d andLeprand the regulation of miR-30d on the biological network associated withLepr.

Lepr;miR-30d;reporter gene

Q936

A

1001-2230（2011）05-0004-03

2011-01-10

国家重点基础研究发展（973）计划（2011CB100804），东北农业大学创新团队计划(CXT005-1-1/CXT005-1-2)。

门晶（1983-），女，硕士研究生，研究方向为泌乳生物学与乳腺生物调控。

李庆章