柔肝泻脂方对非酒精性脂肪肝大鼠 SOD、MDA的影响*

上海中医药大学附属龙华医院内科(上海 200032）

柔肝泻脂方对非酒精性脂肪肝大鼠 SOD、MDA的影响*

陈琼项晓觉毛娜上海中医药大学附属龙华医院内科(上海 200032）

目的:探讨柔肝泻脂方对非酒精性脂肪肝大鼠超氧化物歧化酶(SOD）和脂质过氧化物(LPO）的降解产物丙二醛(MDA）的影响。方法:以高脂饮食建立大鼠脂肪肝模型,造模成功后给予中药“柔肝泻脂方”干预 4周后检测各组大鼠血清和肝匀浆 SOD、MDA的含量变化。结果:模型组大鼠血清和肝匀浆中 SOD水平明显低于正常组,MDA含量明显高于正常组;通过给药治疗,与模型组比较,柔肝泻脂方各组血清及肝匀浆中 SOD水平均明显增高,MDA含量显著降低;与血脂康组比较,大鼠肝匀浆 SOD含量升高及 MDA含量降低以柔肝泻脂方预防组和大剂量组最为显著。结论:柔肝泻脂方可以显著提高血清和肝组织的抗氧化能力,抵御肝细胞的氧应激和过氧化,使肝细胞免受损伤,达到预防和治疗脂肪肝的目的。

MDA反应除干扰肝内脂质代谢外,还导致自由基生成增多,使得细胞膜脂质氧化,肝细胞结构与功能损害[1],MDA反应的产物除破坏生物膜、蛋白质、核酸等大分子物质外,还可诱导炎性细胞浸润,激活肝枯否氏细胞(KupffersCell）和肝星形细胞(HSC）,引发纤维化[2]。因此 MDA异常是导致脂肪肝的重要因素之一[3-4],我们通过高脂饮食建立脂肪肝模型,旨在研究和探讨在全国著名老中医姚培发教授治疗脂肪肝经验方的基础上,进一步改进而成的“柔肝泻脂方”对非酒精性脂肪肝(NAFL）大鼠超氧化物歧化酶(SOD）,脂质过氧化物的降解产物丙二醛(MDA）影响及相关机制。

1 材料 1.1 实验动物 Wistar大鼠:45只,雄性,8周龄,体重:215±15g。中科院上海实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(沪 ）2003-0003。饲养于上海中医药大学实验动物中心 SPF级动物房。

1.2 药物 柔肝泻脂方(何首乌 20g,枸杞子、生地各12g,泽泻 20g,丹参 30g,生山楂 15g）,按处方比例将各药材加水煎煮 2次,过滤 ,合并 ,按人鼠等效剂量换算,浓缩生药浓度为 1.06g/mL(柔肝泻脂方小剂量 ）,2.11g/mL(柔肝泻脂方中剂量）及 4.23g/mL(柔肝泻脂方大剂量）备用。血脂康胶囊 (国药准字号 Z10950029,批号 20030925）,成人日服 1.2g,按人鼠等效剂量换算,研磨后用灭菌蒸馏水稀释浓度为 0.01g/mL。

1.3 试剂 TG:宁波博泰生物技术有限公司 (批号041014）;CHOL:宁波博泰生物技术有限公司(批号 050302）。

1.4 饲料 正常组给予普通颗粒饲料,其它各组 1～ 6周给予高脂饲料。高脂饲料配方如下:10%猪油,1%胆固醇,5%蔗糖,0.5%胆盐,0.2%丙硫氧嘧啶,83.3%基础饲料。

2 方法 2.1 分组 45只大鼠自由饮水进食适应性喂养 1周后,随机分为 6组,正常对照组 5只,模型组、柔肝泻脂方小剂量组、柔肝泻脂方中剂量组、柔肝泻脂方大剂量组、血脂康组各 8只。

2.2 饲料及给药 正常组 1～ 10周给予正常饲料,其余各组 1～ 6周给予高脂饲料,7～ 10周改为正常饲料。正常组及模型组从第 7周起给予蒸馏水 10mL/kg灌胃直至第 10周末。余下各组从第 7周起分别给予不同剂量的柔肝泻脂方或血脂康灌胃,直至第 10周末。

2.3 取材 第 10周末,于最后 1次给药后禁食 12h,2%戊巴比妥纳 40mg/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,一部分室温放置 30min,离心取上清待测血脂、SOD、MDA等指标,迅速剖取肝脏,冰生理盐水洗涤 ,滤纸拭干后称量肝重,于肝右叶距边缘 0.5cm取两块 1cm3装入 eppdorf管,-70℃保存待做肝组织匀浆。

2.4 观测指标 血清、肝匀浆 SOD的测定:按试剂盒说明操作;血清、肝匀浆 MDA的测定:按试剂盒说明操作。

3 结 果 实验过程中各组大鼠均无死亡,各组大鼠体重缓慢持续增长,活动灵敏,组间未见明显差异。各组大鼠血清、肝匀浆 SOD、MDA的变化如下表所示:

3.1 各组大鼠血清 SOD,MDA的变化 见表 1。

表1 各组大鼠血清 SOD,MDA的变化 (±s）

表1 各组大鼠血清 SOD,MDA的变化 (±s）

注:与模型组相比较,△P＜0.05,▲P＜0.01;柔肝泻脂方各组与血脂康组比较,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

组 别 n SOD(NMOL/ML） MDA(NU/ML）正常组 5 196.038±3.708▲ 2.265±0.201▲模型组 8 140.013± 5.800 3.859± 0.430预防组 8 190.307±3.452▲◇ 2.848±0.347▲小剂量组 8 154.736±8.448△ 3.030±0.700中剂量组 8 160.961±6.559▲ 2.550±0.322▲大剂量组 8 195.643±4.511▲◆ 2.285±0.352▲血脂康组 8 170.644±10.601▲ 2.517±0.317▲

图1 正常组×100倍大鼠肝细胞未见脂肪变性

图2 模型组×100倍大鼠肝细胞发生显著脂肪变性

从表 1可知,模型组大鼠血清 SOD含量明显低于正常组,MDA明显高于正常组,差异均有显著性意义 (P＜0.01）。药物干预后,与模型组比较:柔肝泻脂方各组及血脂康组 SOD含量均显著增高(P＜0.05,P＜0.01）;MDA含量均显著降低 P＜0.01(除柔肝泻脂方小剂量组）。

柔肝泻脂方各组与血脂康组比较:柔肝泻脂方预防组、大剂量组血清 SOD含量显著升高(P＜0.05,P＜0.01）;MDA含量无明显差异(P＞0.05）。

3.2 各组大鼠肝匀浆 SOD,MDA的含量变化 见表 2。

表2 各组大鼠肝匀浆 SOD,MDA的变化(±s）

表2 各组大鼠肝匀浆 SOD,MDA的变化(±s）

注:与模型组相比较,△P＜0.05,▲P＜0.01;柔肝泻脂方各组与血脂康组比较,◇P＜0.05,◆P＜0.01。

组 别 n SOD(NMOL/ML） MDA(NU/ML）正常组 5 54.279±4.936▲ 0.193±0.024▲模型组 8 45.575±1.549 0.288±0.034预防组 8 53.134± 0.913▲◆ 0.203± 0.029▲◆小剂量组 85 1.116± 1.705▲ 0.214± 0.026▲◇中剂量组 8 51.023±1.391▲ 0.224± 0.035▲◇大剂量组 8 55.416± 0.727▲◆ 0.188± 0.032▲◆血脂康组 8 50.410±1.466▲ 0.261±0.057

从表 1可知:模型组大鼠肝匀浆 SOD含量明显低于正常组,MDA含量明显高于正常组,差异均有显著性意义(P＜0.01）。药物干预后,与模型组比较:柔肝泻脂方各组 SOD含量均显著增高(P＜0.01）,MDA含量均显著降低(P＜0.01）;血脂康组 SOD含量显著增高 (P＜0.01）,MDA含量有降低趋势,但尚无统计学意义。柔肝泻脂方各组与血脂康组比较:SOD含量预防组和大剂量组升高显著(P＜0.01）,MDA含量各组均显著降低(P＜0.05,P＜0.01）。

3.3 肝组织病理变化 HE染色观察 正常组大鼠肝细胞未见脂肪变性(见图 1）,模型组大鼠肝细胞发生显著脂肪变性(见图 2）,治疗组肝细胞脂肪变程度明显较轻(见图 3）,对照组肝细胞脂肪变程度好于模型组 (见图 4）。

图3 治疗组×100倍肝细胞脂肪变程度明显较轻

图4 对照组×100倍肝细胞脂肪变程度好于模型组

4 讨 论(SOD）是超氧离子自由基的专一特效金属歧化酶,通过清除自由基,起到保护机体的作用,对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基,氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,形成脂质过氧化酶 MDA,MDA的含量反映机体内脂质过氧化的程度,间接反应出肝细胞受损程度。各种原因导致的肝脏脂肪沉积,肝细胞脂肪变性,主要是因为大量还原型辅酶 1(NADH）作用的结果,NADH浓度增高抑制脂肪酸的β氧化 ,使细胞内游离脂肪酸增加,游离脂肪酸浓度增加可促进氧化物酶体的 β氧化,产生大量高度活性的自由基,自由基使脂质过氧化,脂质过氧化后产生 MDA增加,MDA增加使细胞内抗氧化剂 SOD消耗增加,含量显著性下降。这一点通过本实验中也得以证实:模型组大鼠血清和肝匀浆中 SOD水平明显低于正常组,MDA含量明显高于正常组。通过药物干预后,与模型组比较,柔肝泻脂方各组血清及肝匀浆中 SOD水平均明显增高,各组血清中 MDA含量显著降低。与血脂康组比较:柔肝泻脂方预防组和大剂量组大鼠肝匀浆 SOD含量升高及MDA含量降低最为显著。说明脂肪肝肝内脂质沉积,引起脂质过氧化反应,导致抗氧化能力下降,自由基生成增多,而自由基可通过氧化细胞膜的脂质导致肝细胞结构与功能的变化,因此脂质沉积的增多加重了脂质过氧化反应,而脂质过氧化反应可干扰肝内脂类代谢。药物干预后显示,柔肝泻脂方可以显著提高血清和肝组织的抗氧化能力,抵御肝细胞的氧应激和过氧化,使肝细胞免受损伤,达到治疗脂肪肝的目的,这也是柔肝泻脂方治疗脂肪肝的机制之一。柔肝泻脂方由何首乌、枸杞子、生地、虎杖、菝葜等组成,药理学研究表明,何首乌能从胆固醇的吸收、代谢等多途径防治高脂血症及动脉硬化症,降低血液的高凝状态,并能降低组织中 MDA含量,提高机体组织细胞SOD的活性以及减少氧自由基对组织细胞的损害[5]。枸杞能提高肝组织中超氧化物酶 SOD的活性,维持机体氧化及抗氧化系统的动态平衡,从而使组织的细胞免受自由基的侵害[6],此外枸杞多糖对动脉粥样硬化还有明显的预防和治疗作用,可能与其抗氧化、免疫调节、提高 HDL-C/Tch有关[7]。菝葜具有活血化瘀的药理作用,表现在抑制血小板聚集和延长内源性凝血时间,并同时伴有对纤维蛋白原生成的影响,对血小板的数目没有明显影响[8-9]。并有报道表明复方菝葜有增加荷瘤鼠血清中SOD活力,降低 MDA含量的作用[10]。虎杖中的白藜芦醇是一个自由基清除剂 ,虎杖还具有改善微循环,抑制白细胞,血小板与内皮细胞黏附的作用。由此可推测,柔肝泻脂方可能通过清除自由基,抗氧化,调节胆固醇的吸收代谢等多途径来治疗和干预脂肪肝,达到治愈脂肪肝目的。

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柔肝泻脂方 /药效学 大鼠 实验研发

R57

A

1000-7369(2011）01-0103-03

*上海市教委课题(编号 02ck01）

(收稿 2010-08-15;修回 2010-09-20）