川芎嗪对皮质神经元在氧糖剥夺损伤中的保护作用

王 菲 王广生 强 辉 强 杰 陕西省第七建筑工程公司职工医院(宝鸡 721000）

川芎嗪对皮质神经元在氧糖剥夺损伤中的保护作用

王 菲 王广生△强 辉▲强 杰△陕西省第七建筑工程公司职工医院(宝鸡 721000）

目的:探讨川芎嗪对培养大鼠皮质神经元在氧糖剥夺损伤中的保护作用及可能机制。方法:原代培养新生大鼠皮质神经元,利用氧糖剥夺建立皮质神经元缺血再灌损伤模型。应用四甲基偶氮唑盐(MTT）测定细胞活力。应用乳酸脱氢酶(LDH）、超氧化物歧化酶(SOD）活性及丙二醛(MDA）试剂盒分别检测 LDH、SOD活性及 MDA含量。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:氧糖剥夺损伤后细胞存活率降低,LDH释放上升,SOD活性下降,MDA含量明显增加,细胞凋亡率显著升高(P＜0.05）。川芎嗪可浓度依赖性地提高细胞的存活率和 SOD水平,减少 LDH释放和 MDA含量,抑制细胞凋亡(P＜0.05）。结论:川芎嗪对培养大鼠皮质神经元在氧糖剥夺损伤中有保护作用,其保护机制可能与葛根素稳定细胞膜,减轻氧化损伤,及抑制细胞凋亡有关。

缺血再灌注损伤的发生与氧自由基释放、线粒体损伤、钙离子超载、炎症细胞的介入及参与细胞信号转导的信号分子的激活等因素有关[1～3]。缺血再灌注损伤的共性为各种器官、组织、细胞遭受了病程久暂、轻重不同的缺氧及其后更为严重的复氧损伤。川芎嗪(Tetramethyl pyrazine,TMP）是从川芎等植物中分离出的一种生物碱单体,化学结构为四甲基吡嗪。研究发现,川芎嗪对中枢神经系统缺血 /再灌注损伤有明显保护作用,但缺少离体细胞学的实验证据,且保护作用机制尚不清楚。本实验采用体外培养的皮质神经元为研究对象,以氧糖剥夺方法建立缺氧缺糖 /复氧复糖损伤的离体模型,观察川芎嗪的神经保护作用并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法1.1 试剂和仪器 MTT,DMSO购自美国 Sigma公司;LDH检测试剂盒,SOD检测试剂盒及 MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所 ;AnnexinV/FITC试剂盒购自上海晶美生物工程公司;川芎嗪(批号:H62021030）甘肃兰药药业集团公司。二氧化碳培养箱(美国 SHELLAB公司）;倒置显微镜(日本奥林巴斯公司）;全自动酶标仪(美国BIO-TEK公司 ）;荧光分光光度计 (日本 Shimadzu公司）流式细胞仪(美国 Becton-Dickinson公司）。

1.2 大脑皮层神经细胞的培养 1～ 3天 SD大鼠,由西安交通大学实验动物中心提供,并征得西安交通大学动物伦理委员会同意。无菌条件下分离 1-3天 SD大鼠的大脑皮层置于含 2.5g/L胰蛋白酶的 D-Hank’s液中,37℃消化 15分,加入含100ml/L牛血清的 DMEM/F12培养液中止胰酶的作用,移液管轻轻吹打为单细胞悬液,调整细胞密度为 (1～ 2）× 105个 /ml,接种于预先经多聚赖氨酸覆盖的 96孔板中。接种的第 5～7天加人阿糖胞苷 (终浓度为 0.01mmol/L）处理 24小时以抑制胶质细胞的增殖。当接种细胞融合达 80%后,常规消化后传代培养。取第 3代细胞进行鉴定及相关实验。

1.3 体外缺氧缺糖 /复氧复糖(OGD-R）模型的建立 取生长期大脑皮层神经细胞,将培养液换成无糖 DMEM培养液,用 95%N2～～5%CO2混合气驱赶培养液和培养板中的空气,严密封口后 ,置于 37℃含 95%N2～ 5%CO2的密闭培养箱中,模拟缺血 ,4h后取出培养板,更换常规 DMEM培养液,并恢复正常培养环境,继续培养 24h,模拟再灌注,建立细胞 OGD-R模型更换正常培养液时,TMP组同时加入相应浓度的 TMP。

1.4 细胞分组和处理 实验随机分为三组:对照组,OGD-R模型组,TMP组 (终浓度分别为 0.05μmol/L,0.1μmol/L和 0.2μmol/L）。 每组所用 96孔板的孔数 n=6。

1.5 指标的检测 1.5.1MTT检测:将细胞按 1×104/mL密度接种于 96孔培养板 ,分组处理如前所述。加入 5g/L的MTT20μL,37℃孵育 4h,离心后去除上清液,加入 150μL DMSO振荡 5min,使结晶物充分溶解,置入酶标仪在 570nm检测 A值。

1.5.2 LDH检测:将细胞按 1×104/ml密度接种于 96孔培养板,分组处理如前所述。吸取待测 96孔板中的细胞培养液,按 LDH试剂盒说明书要求进行检测。

1.5.3 :SOD活力及 MDA含量测定 将细胞以 106/ml的密度接种于 24孔板中,每孔 0.5mI,每组 5孔。收集细胞,超声破碎细胞,离心后取上清待测,使用南京建成生物工程研究所检测试剂盒,按说明书方法,测定 SOD活力及 MDA的含量。

1.5.4 流式细胞仪检测凋亡:细胞培养,分组处理如前所述。按 AnnexinV-FITC/PI试剂盒操作说明检测细胞凋亡。用2.5g/L胰蛋白酶消化各组细胞,用 4℃预冷的 PBS洗涤 2次,离心(1000r/min,5min）后除去细胞碎片,用结合缓冲液重悬细胞,调节其细胞数为 1.0× 106/mL。取细胞悬液 100μL于 5 mL流式管中,加入 AnnexinV-FITC5μL和 2μg/mLPI 10μL,混匀后室温避光孵育 15min,应用流式细胞仪分析各组细胞凋亡率。

1.6 统计学处理 采用 SPSS13.0统计软件包进行分析,所测值以均数±标准差(±s）表示,组间比较采用单因素方差分析。 P＜0.05,认为差异有统计学意义。

2 结 果2.1 TMP对细胞活力的影响 经各浓度TMP对正常大脑皮层神经细胞活力检测发现,与正常细胞活力相比无差异(P＞ 0.05）,这说明 TMP在 0.05-0.2μmol/L的浓度范围内对正常培养 PC12细胞没有明显影响。OGD-R后细胞活力由(100.13±9.72）%下降到(36.43± 5.87）%(P＜0.05）。 TMP可以减轻细胞损伤 ,按浓度 (0.05μmol/L、 0.1μmol/L、0.2μmol/L）其细胞活力分别提高到(45.21± 6.14）%,(64.22±7.81）%,(79.94±8.12）%,与 OGD-R组相比差异具有统计学意义(P＜0.05）。

2.2 TMP对细胞内 LDH的影响 结果如表 1所示,缺血能够引起大脑皮层神经细胞胞内 LDH释放,再灌注时加入TMP,能够抑制 LDH释放,而且随着药物浓度增加 LDH释放量减少。

2.3 TMP对细胞内 SOD及 MDA的影响 与对照组相比,OGD-R降低了 SOD活性,当细胞再灌注加入 TMP处理后,SOD活性得到了明显的提高。OGD-R后 MDA含量明显增加,应用 TMP治疗可显著降低其含量,且随着药物浓度增加MDA含量也明显减少(表 1）。

2.4 TMP对缺氧缺糖/复氧复糖细胞凋亡的影响 与对照组比较,OGD-R模型组细胞凋亡率明显升高 (P＜0.01）。与模型组比较 ,TMP0.05μmol/L、 0.1μmol/L 和 0.2μmol/L 各浓度组细胞凋亡率降低,呈浓度依赖关系,差异有统计学意义(表 5）。

表1 TMP对细胞 LDH释放、SOD活性及 MDA含量的影响

表2 TMP对细胞凋亡率的影响

讨 论 整体动物模型研究由于易受体内外多种因素影响,使一些药物研究的结果很不稳定,不利于药物作用的正确评估。体外实验采用神经细胞原代培养,模拟人体缺血缺氧状态可以排除体内干扰,探讨缺血性神经元损伤机制。模拟缺血性损伤的离体模型有多种方法,目前公认的是细胞缺氧合并培养基缺糖模型[4]。本实验结果表明,氧糖剥夺模型可以较好的模拟体内缺血性损伤,具有起效较快、比氰化物等使用安全的特点,是制作缺血模型和用于简单药物评价的有利方法。

川芎嗪系川芎等植物中分离的一种生物碱单体,化学结构为四甲基吡嗪。近年研究发现,TMP可透过血脑屏障,通过阻滞钙离子通道、清除氧自由基、影响内皮素和一氧化氮合成等对中枢神经系统产生多种作用,其应用价值得到广泛承认[5]。已研究证明川芎嗪对中枢神经系统缺血再灌注损伤有明显保护作用[6～10]。但目前缺少离体细胞学的实验证据,且保护作用机制尚不清楚。

本实验采用 MDA、SOD及 LDH等指标观察 TMP对缺氧缺糖 /复氧复糖损伤神经细胞的影响。MDA是一种在缺氧状态下生物膜中的多不饱和脂肪酸受自由基攻击所形成的一种脂质过氧化物,测定 MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化损伤的程度。SOD是以氧自由基连锁反应前体物 O2-为唯一底物的天然酶类清除剂,构成了机体抗活性氧的第一道防线。MDA的高低间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度,而 SOD活力的高低直接反应了机体清除氧自由基的能力。乳酸脱氢酶(LDH）是一种细胞内标志酶,广泛存在于各种组织细胞的胞浆中。当细胞受损时,细胞膜通透性发生改变,LDH释放量明显增加。因而检测 LDH漏出量能够定量评价细胞损伤程度[11]。MTT为淡黄色粉末,易被水溶解和透过细胞膜被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原,形成不溶于水的蓝紫色结晶。该结晶可溶于 DMSO,通过分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光度值,因此吸光度值大小可间接反映细胞存活数量及细胞活性。本实验结果发现:缺氧缺糖/复氧复糖后细胞存活率降低,LDH释放上升,SOD活性下降,MDA含量明显增加;TMP可浓度依赖性地明显提高缺氧缺糖 /复氧复糖损伤细胞的存活率和 SOD水平,减少 LDH释放和 MDA含量。这提示 TMP能够通过抗氧化作用发挥其对缺氧缺糖 /复氧复糖损伤细胞的保护作用。

缺血再灌注导致神经细胞损伤的机理十分复杂,涉及钙离子超载、细胞凋亡、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸增多等多种复杂因素。研究发现细胞凋亡与脑缺血、脑缺血再灌注及某些退行性神经病变等有关[12～14]。其中,细胞凋亡是多种生理病理刺激引发的细胞自杀过程,是生物体内普遍存在的不同于坏死的生理性细胞死亡。细胞凋亡是一个渐进的过程,凋亡早期的细胞结构变化轻微,胞膜尚未破坏,此时通过治疗干预手段仍能逆转这部分细胞的功能。因此,针对早期凋亡细胞功能的保护作用,抑制凋亡过程的继续,才是药物作用的关键靶点。本实验采用培养的神经细胞,建立缺氧损伤模型,应用琼脂糖凝胶电泳检测到 DNA梯带,通过流式细胞仪检测,发现 TMP可明显降低再灌注损伤 PC12细胞凋亡率。提示 TMP对拟缺血再灌注PC12细胞的保护作用机制可能与其抑制凋亡有关。

综上所述,川芎嗪对培养大鼠皮质神经元在氧糖剥夺损伤中有保护作用,其保护机制可能与葛根素稳定细胞膜,减轻氧化损伤,及抑制细胞凋亡有关。

[1] Sadi K,GianluigiB,Jeffrey A,etal.Resveratrol,a Natural Red W ine Polyphenol,Reduces Ischem ia-Reperfusion-Induced Spinal Cord Injury[J].Ann Thorac Surg,2005,80(6):2242-2249.

[2] 段有文,吕 刚,吴海龙,等.肿瘤坏死因子及中性粒细胞在脊髓继发性损伤中的作用[J].中华实验外科杂志,2006,23(6):737-738.

[3] Shuzo O,Atsushi S,Takeshi H,et al.The c-Jun N-Terminal p roteinkinase signaling pathw ay mediates bax ac tivation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with bim after transient focalcerebral ischem ia[J].J Neurosci,2004,24(36):7879-7887.

[4] Goldberg W J,Kadingo RM,Barrett JN.Effec ts of ischem ia-like condition on cu ltured neurons:p rotection by low Na+,low Ca2+ so lurions[J].JNeurosci,1986,6(1):3144-3151.

[5] 纳 鑫,汪雪兰,皮荣标.川芎嗪对中枢神经系统的药理作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理,2008,19(1):77-80.

[6] Fan LH,Wang KZ,Cheng B,et a l.Anti-apop totic and neurop rotective effects of Tetramethy lpy razine following spinal cord ischem ia in rabbits[J].BM C Neuroscience,2006,7:48-52.

[7] Liao SL, Kao TK, Chen WY, et al.Tetramethylpyrazine reduces ischem ic brain injury in rats[J].Neurosci Lett,2004,372(1-2):40-45.

[8] Kao TK,Ou YC,Kuo JS,et al.Neuroprotec tion by tetramethylpyrazineagainst ischem ic brain injury in rats[J].Neurochem Int,2006,48(3):166-176.

[9] Hsiao q,Chen YC,Lin JH,et al.Inhibitory mechanism s of tetramethy lpyrazine in m idd le cerebral artery occlusion(MCAO)-induced focal cerebral ischemia in rats[J].Planta Med,2006,72(5):411-417.

[10] Wu B,Liu M,Liu H,et a1.M eta-analysis of traditional Chinese patent medicine for ischem ic stroke[J].Stroke,2007,38(6):1973.

[11] Koh JY,Choi DW.Quantitative determ ination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate deh ydrogenase efflux assay[J].JNeurosci Methods,1987,20(1):83-90.

[12] Zhang F,Yin W,Chen J.Apop tosis in cerebral ischem ia:executional and regulatory signalingm echanism s[J].Neurol Res,2004,26(8):835-845.

[13] Sugawara T,Fu jim ura M,Noshita N,et al.Neuronal death/survival signaling pathw ays in cerebral ischem ia[J].Neurorx,2004,1(1):17-25.

[14] Chan PH.M itochondria and neuronal death/surviva l signaling pathw ays in cerebral ischemia [J].Neurochem Res,2004,29(11):1943-1949.

川芎嗪 /药效学 大鼠 实验研究

R28

A

1000-7369(2011）01-0108-04

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▲陕西省人民医院(西安 710068）

(收稿 2010-08-09;修回 2010-09-12）