宫颈鳞癌组织中P-gp、LRP的表达及临床意义

张 岩,李 宁

(1三亚市人民医院,海南三亚 572000;2遵义医学院附属医院肿瘤医院)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,随着化疗药物的不断开发及给药途径和方法的改进,辅助化疗对晚期、复发和转移宫颈癌患者的治疗起着越来越重要的作用;但有部分宫颈癌患者化疗效果不佳。2007年1月～2009年1月,我们采用MaxVision免疫组化法和Real time RT-PCR检测宫颈鳞癌组织中多药耐药基因蛋白(P-gp)和肺耐药蛋白(LRP)及P-gp编码基因(mdr1)、LRP编码基因(lrp)表达情况,旨在对宫颈鳞癌化疗药物的选择提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集我院经手术切除宫颈鳞癌标本30份(宫颈癌组),患者年龄 29～65岁,中位年龄 48岁;均经病理证实诊断,术前均未行放疗、化疗。按FIGO 1995年修订的标准临床分期Ⅰa期10例,Ⅰb期11例,Ⅱa期 9例;高中分化18例,低分化 12例;有淋巴结转移 11例。另选 30份正常子宫颈组织作为正常组,两组一般资料具有可比性。

1.2 mdr1 mRNA、lrp mRNA检测 采用Real time RT-PCR法。按Trizol Reagant试剂盒说明书提取总RNA,用紫外分光光度计检测,A 280/A260值在 1.8～2.0为合格,-80℃保存备用。CDNA合成：按RNA逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系,反应条件：37℃15min,85℃5 s。荧光定量PCR：按荧光定量PCR试剂盒说明书配制PCR总反应体系,反应条件：95℃10 s,循环1次;95℃5 s,60℃20 s,循环40次。用EASY Dilution将cDNA溶液按51、52、53、54、55拷贝数的阳性标准品为模板,分别应用上述引物通过Real time RT-PCR法建立用于检测目的基因与GAPDH表达水平的两条标准曲线。曲线斜率控制在-3.3左右,相关系数(r)＞0.99。按检测指标与GAPDH比值计算mRNA的表达量,实验重复3次。

1.3 P-gp、LRP蛋白检测 所有标本经10%甲醛固定,常规石蜡包埋,连续 4μm切片,HE染色和MaxVision免疫组化染色。石蜡切片脱蜡至水,3% H2O2去除内源性过氧化物酶,0.01 mol/L柠檬酸缓冲液微波修复抗原;加入一抗、二抗,孵育反应,DAB染色,苏木素复染。PBS缓冲液代替一抗作阴性对照,已知乳腺癌阳性标本作阳性对照。P-gp、LRP阳性为胞质或胞膜中有黄色颗粒沉淀。高倍镜下随机选择 5个视野,每个视野计数 200个细胞,细胞阳性数≥10%者为阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。Real time RT-PCR结果用两组独立样本的t检验,计量数据用±s表示;P-gp和LRP表达与临床病理因素间的关系采用χ2检验;mdr1、lrp mRNA表达量间及LRP、P-gp表达的相关性采用计数资料相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 mdr1 mRNA、lrp mRNA表达 宫颈癌组及正常组mdr1 mRNA表达量分别为45.830±0.570、43.567±0.151,lrp mRNA表达量分别为49.989± 0.762、45.138±0.550,P均＜0.01。

2.2 P-gp、LRP蛋白表达 宫颈癌组及正常组P-gp阳性表达率分别为83.3%、20%,LRP阳性表达率分别为86.7%、26.7%,P均＜0.01。

2.3 P-gp、LRP蛋白表达与宫颈鳞癌临床病理参数的相关性 见表1。

2.4 相关性分析 mdr1 mRNA与lrp mRNA表达无相关性(r=0.117,P＞0.05),P-gp与LRP表达亦无相关性(r=0.175,P＞0.05)。

3 讨论

化疗是治疗宫颈癌的重要手段,但临床部分病例对多种化疗药物不敏感,产生了对多种分子结构不同、作用机制各异的抗肿瘤药物的交叉耐药性。近年研究表明,肿瘤耐药机制多涉及P-gp、LRP的过度表达[1～3]。

表1 P-gp、LRP蛋白表达与宫颈鳞癌临床病理参数的相关性

P-gp是mdr1编码的跨膜糖蛋白,为一种ATP依赖性跨膜转运泵,P-gp的跨膜结构具有能量依赖性“药泵”功能,能使细胞内药物转出细胞外,造成细胞内药物浓度下降,细胞毒作用降低或完全丧失,细胞产生耐药[4]。本研究宫颈癌组P-gp阳性表达率高于正常组,提示肿瘤细胞在增殖过程中可能存在较为固定的突变频率,每次突变均可导致耐药性瘤株的出现,其耐药机制目前最公认的是药物膜泵假说,有以下三种模式：①药物扩散进入细胞内后与P-gp结合,ATP水解提供能量,将药物从胞内泵出胞外,细胞内药物浓度不断下降,其细胞毒作用因而减弱至丧失,出现耐药现象。②许多亲脂性抗癌药物穿过细胞膜所需的时间较长,在脂质双分子层之间便足以与P-gp结合,药物未进入细胞内就被泵出,发挥所谓“疏水真空泵”的作用。③P-gp亦存在于胞质内膜上,进入细胞内的药物先被泵入胞质内膜腔,再排出细胞外。研究表明,阿霉素、长春新碱及依托泊苷对mdr1表达阳性的胃癌细胞,其化疗作用十分有限[5]。Konishi等[6]用阿霉素、顺铂、丝裂霉素及氟尿嘧啶行动脉内灌注化疗治疗局部晚期或巨块型宫颈癌2个疗程,发现P-gp蛋白阴性表达病例比P-gp蛋白阳性表达病例肿瘤缩小更明显。因此,P-gp蛋白阳性表达可能是导致宫颈癌患者化疗失败的原因之一。

LRP作为人体的主要穹窿蛋白,广泛分布于细胞器上。LRP引起多药耐药的机制与P-gp不同,可能有：①使顺铂、烷化剂等以细胞核为靶目标的药物不能通过核孔进入细胞核。部分药物即使进入了细胞核内,亦会很快转运到细胞质中。②使细胞质中的药物进入运输囊泡,呈房室性分布,最终通过胞吐方式排到细胞外[7]。Izquierdo等[8]对57例FIGOⅢ～Ⅳ期卵巢癌患者术后采用以铂类或烷化剂为主的化疗方案,发现 LRP阳性表达的患者,其化疗反应较差、生存时间明显缩短。本研究宫颈癌组LRP阳性表达率明显高于正常组,表明在宫颈癌组织中由LRP介导的非P-gp耐药相当普遍,值得临床高度重视。

本研究宫颈癌组中P-gp、LRP蛋白阳性率及mRNA表达量明显高于正常组,提示其过度表达有可能成为一个早期信号,作为宫颈组织发生癌变的一个预测指标。本研究P-gp、LRP蛋白与mRNA表达量之间无相关性,表明在宫颈癌组织中不同的基因通过各自的途径产生多药耐药,彼此之间的机制是独立而不相互依赖的。同一宫颈癌组织中存在多个多药耐药基因同时表达,说明宫颈癌组织多药耐药现象为多重多药耐药,存在多样性和普遍性。本研究还发现,P-gp、LRP表达与临床分期、组织学类型、淋巴结转移均无关,表明二者有可能作为预测子宫颈癌化疗敏感性的参考指标。

总之,肿瘤耐药是多因素参与的过程,同时检测多个多药耐药基因产物,可以对肿瘤的多药耐药性进行较准确的评价,并对检测结果进行正确判断,做到肿瘤化疗个体化。联合检测P-gp、LRP在宫颈癌中的表达对宫颈癌化疗药物的选择及预后判断均有重要参考价值。

[1]Borst P,Evers R,Kool M,et al.The multidrug resistance protein family[J].Biochim Biophys Acta,1999,1461(2)：347-357.

[2]Tada Y,Wada M,Migita T,etal.Increased exp ression ofmultidrug resistance-associated p roteins in bladder cancer during clinical course and drug resistance to doxorubicin[J].Int JCancer,2002, 98(4)：630-635.

[3]Konig J,Rost D,Cui Y,et al.Characterization of the human multidrug resistance p rotein isoform MRP3 localized to the basolateral hepatocytemembrane[J].Hepatology,1999,29(4)：1156-1163.

[4]Sharom FJ.Shedding light on drug transport：structureand function of the P-glycop rotein multidrug transporter(ABCB1)[J].Biochem Cell Biol,2006,84(6)：979-992.

[5]董荣坤,毛仁东,张笃,等.胃癌组织中 P-糖蛋白、肺耐药蛋白与化疗敏感性的相关性分析[J].郧阳医学院学报,2007,26(1)：21.

[6]Konishi I,Nanbu K,Mandai M,et al.Tumor response to neoad2juvant chemotherapy correlateswith the expression of P-glycoprotein and PCNA but not GST-piin the tumor cellsofcervical carcinoma[J].Gynecol Oncol,1998,70(3)：365-371.

[7]Izquierdo MA,Scheffer GL,Flens MJ,et al.Major vault protein LRP-related multidrug resistance[J].Eur J Cancer,1996,32A (6)：979.

[8]Izquierdo MA,van der Zee AG,Vermorken JB,et al.Drug resistance-associatedmarker Lrp for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma[J].JNatl Cancer Inst,1995,87(16)：1230.