腈水解酶 2基因沉默细胞模型的制备

吕 杨,苏华宾,谢院生,陈香美

(解放军总医院肾病科,全军肾脏病研究所暨重点实验室,北京 100853)

siRNA技术是目前最常用的基因干扰技术,可对靶基因进行基因沉默,并根据其产生的生物学作用分析基因的功能。目前最常用的是化学合成的siRNA,其主要具有合成时间短、转染效率高、价格适中的优点。但缺点是无法制备稳定的基因沉默模型,容易降解,合成量较小而无法用于体内试验。此种情况下,质粒载体逐渐被大家接受和应用[1]。2010年 7月,我们采用siRNA质粒转染技术构建腈水解酶2(NIT2)基因沉默模型,旨在为NIT2基因功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI1640培养液,JETPRIMER转染试剂,胎牛血清,Trizol,逆转录试剂盒、SYBRGREEN 1 QPCR试剂盒,低温高速离心机,定量PCR仪。

1.2 原代大鼠系膜细胞(RMC)培养 选取3月龄雄性Wistar大鼠,取双侧肾脏,利用筛网技术纯化出肾小球,加入V型胶原酶(0.5 mg/m l)消化15 min, 15%胎牛血清的RPMI1640培养液(含5μg/ml胰岛素,5 U/ml肝素),37℃、5%CO2条件下培养原代系膜细胞。实验主要使用 10～15代原代细胞[2]。

1.3 siRNA质粒构建及转染 阴性对照质粒靶序列：AGGACATGAATAAAGACCA,NIT2靶序列：CCCGAGCTGTTGATAATCA。上海吉玛公司负责将这些靶序列克隆到pGU6/GFP/Neo中。最后通过质粒提取,得到siCon和siNIT2质粒。取4×105个细胞接种到6孔板上,24 h后待细胞达到80%融合度时,采用JETPRIMER进行转染。具体方法如下：取2μg质粒,加入到200μl转染buffer中,混匀后,加入JETPRIME试剂4μl,混匀,室温15min,加入到培养液中[3],8 h后换液,48 h提取RNA。荧光显微镜下(×200)观察转染情况。质粒的转染效率=荧光显微镜下发出绿色荧光的系膜细胞数量/光镜下总体系膜细胞数量。

1.4 NIT2 mRNA水平检测 采用SYBR GREEN 1定量RT-PCR法。向每孔加入0.5ml Trizol,收集裂解液,加入100μl氯仿,混匀,10 000 g离心10min,取上清,加入等体积的异丙醇,室温,10 min,10 000 g离心10min,75%乙醇洗2次,用无RNAase水溶解,得到RNA。采用逆转录试剂盒进行逆转录。采用2×SYBR GREEN 1QPCR试剂盒,进行定量PCR反应。NIT2引物：上游：5'-TTC CGC CTG GCC CTC ATC-3',下游：5'-AAT TGA AGC ACT CCG GCA GAT-3',产物长度139 bp。产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果采用 2-△△CT方法进行分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。两两比较采用t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞转染效率 通过计算得出结果为50%。2.2 NIT2mRNA水平 定量PCR结果示荧光曲线在 18～25个循环开始上升,琼脂糖凝胶电泳结果示PCR产物条带特异,无明显杂带和引物二聚体(见图1),siNIT2质粒转染48 h后,NIT2细胞显著受抑,siNIT2组的NIT2mRNA表达量是siCon组的0.3倍(P＜0.05)。

图1 PCR产物1%琼脂糖电泳图

3 讨论

NIT2属于腈水解酶超家族的成员,腈水解酶超家族特点是具有腈水解结构域,主要包括腈水解酶、酰胺酶、氨甲酰酶、N酰基转移酶等 13个分支,其广泛存在于动物、植物和微生物中,参与生物的非肽类碳—氮化合物水解反应。但在所有分支中只有腈水解酶具有水解腈的活性,而其他分支参与的是酰胺酶或酰胺浓缩活性以及结构域调节的功能,而NIT2就属于腈水解酶分支,对系膜细胞的增殖有重要的调控作用。我们的前期研究表明,NIT2基因过表达可显著抑制系膜细胞的增殖,此与Lin等结果相似,他们发现NIT2在多种器官中均有表达,且在肝脏和肾脏中表达量最高,将NIT2转染到Hela细胞中,发现NIT2主要表达于胞质,且可抑制 Hela细胞的增殖[4]。此外,NIT2和NIT1有40%的同源性,提示其可能具有相似功能。NIT1是可能的肿瘤抑制基因,可以诱导Caspase介导的细胞凋亡,这些结果均提示NIT2在系膜细胞增殖中的重要性[5]。因此,研究siNIT2对系膜细胞的作用有助于阐明NIT2基因在系膜细胞增殖中的功能。

NIT2调控系膜增殖的机制研究对于阐明肾脏病理生理学变化有重要意义。在肾脏衰老过程中,系膜细胞增殖能力下降,从而导致拮抗外界刺激的能力下降,最终导致肾脏功能的减退,而在这个过程中,NIT2可能通过调控系膜细胞增殖能力,影响肾脏衰老的进程。在系膜增殖性肾炎中,NIT2对系膜增殖的作用可能是系膜增殖重要的发病机制。我们发现在大鼠抗Thy-1肾炎模型中,NIT2表达发生显著变化,提示NIT2可能在系膜增殖性肾炎中有重要的调控作用,有可能成为治疗系膜增殖性肾炎重要的分子靶点。而进行上述研究的基础,就是建立NIT2过表达和低表达的细胞模型。在前期工作中,我们成功的建立了NIT2过表达的细胞模型。本研究重点是利用siNIT2质粒建立NIT2低表达的细胞模型。

通过转染siRNA质粒抑制基因mRNA水平,必须要解决好两个问题：①siRNA质粒对基因的抑制效率;②siRNA质粒转染效率。通常情况下可先用化学合成的siRNA转染细胞,观察其抑制效率;再将这段靶序列克隆到质粒中进行实验,但此不能完全保证siRNA质粒是有效的。因此,可多设计几个片段,选择抑制效率高的片段进行实验,siRNA质粒转染是个棘手的问题,因原代系膜细胞细胞膜较厚,不容易穿透。普通脂质体转染对原代系膜细胞效果不是非常好,但经过对不同转染试剂的挑选和条件的摸索,我们发现在延长转染时间条件下(说明书建议4 h),JETPRIME脂质体可获取较高的转染效率,此为日后转染原代系膜细胞提供了新方法。

总之,本研究应用siRNA质粒转染技术抑制了原代系膜细胞中NIT2基因的mRNA水平,成功建立了NIT2沉默细胞模型,为研究NIT2调控系膜细胞增殖机制奠定了基础。

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