鳞癌与腺癌患者血清差异蛋白质组分析

胡琼英,彭 瑛,王开正＊,郑旅芳,丁银环,谭小林,李小琼,严 莉

(1泸州医学院附属医院,四川泸州 646000;2北京中科亚光生物工程公司)

表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS技术)是继基因芯片后出现的新一代生物芯片技术,可直接采用血液、脑脊液、细胞裂解液等粗生物样品进行分析而无需预先处理,每次分析只需 0.5～5μl或 2 000个细胞的超微量样本[1]。但目前SELDI-TOF-MS技术均以病理诊断作为“金标准”去研究和验证这种技术在临床应用的诊断效率,尚无从病理分型角度分析不同分型和潜在标志物的关系及这些潜在标志物和具体肿瘤蛋白表达的联系。近期我们采用差异蛋白组学方法,将SELDI-TOF-MS检测的鳞癌、腺癌及正常人的蛋白指纹图筛选出一组差异表达的标志蛋白,旨在为癌症诊断和病理分型的研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料 202份来源于本院 2008～2009年住院患者的冻存血清标本,患者男 113例,女 89例;年龄40～70岁。均经病理检查证实诊断,其中鳞癌 120例(鳞癌组),包括口腔癌10例、肺癌37例、食管癌44例、喉癌 29例;腺癌 82例(腺癌组),包括口腔癌1例、肺癌 7例、胃癌 36例、贲门癌3例、结肠癌19例、直肠癌 16例。另选择 52份取自同期体检健康者(男26例,女 26例;年龄20～50岁)的冻存血清标本作为对照组。

1.2 差异蛋白质筛选

1.2.1 样品准备 取出冻存的血清标本,置于冰上融解,4℃、10 000 r/m in离心2 min;将分离的血清与PBSBuffer(10×)、标准分子肽的混合物(1 000 μg/m l)及半饱和SPA按一定比例混合,静置5～10 min。吸取待测混合血清样品2μl,于活化的金芯片上点样,并预留出一个空白点做空白对照,晾干。每点加1μl半饱和SPA,晾干,待检。

1.2.2 质谱检测 采用PBSⅡ/C型蛋白质指纹图谱仪对结合在金芯片表面的血清蛋白质进行检测,设定优化范围为2 000～20 000质荷比(m/z),最高检测相对分子质量为100 000m/z,激光强度220,检测敏感度为9。Ciphergen Protein Chip软件自动采集质谱数据,除噪、平滑处理。

1.2.3 质谱图二维内标校准 仪器采用塞弗吉公司提供的all-in-one蛋白质标准分子进行外标校正。再用加入已知相对分子质量的双分子内标物进行检测,通过内标物质在质谱图中横坐标(质荷比)和纵坐标(强度)响应值校准,消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响,提高分析结果的准确度和重复性[2]。

1.3 统计学方法 采用Biomarker Wizard 3.1版软件分析各组血清差异蛋白质谱峰。设定有意义的蛋白质峰出现频率阈值为 10%,分别设定信噪比(S/ N)＞5,对初步筛选的蛋白质峰进行F检验(所用软件为SPSS 15.0),检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 差异蛋白质峰检测 三组质谱图共得到83个差异蛋白(P均＜0.05),其中5个表达差异最明显的蛋白质峰其 m/z分别为 2 953、3 285、6 625、6 646、9 257。

2.2 差异蛋白质峰的表达 检测到的差异蛋白质峰中m/z为2 953、3 285的蛋白峰在鳞癌中为低表达,腺癌中为高表达,二者归一化强度记录情况良好。m/z为 6 625、6 646、9 255的蛋白峰在鳞癌中为高表达,腺癌中为低表达,见图 1。

图1 鳞癌、腺癌和对照者血清蛋白指纹图谱

2.3 F检验 五个差异蛋白质峰强度F值分别为20.706、27.164、12.035、19.882、8.441,P均 ＜0.05。进一步两两比较,P均 ＜0.05。见表 1。

表1 各组差异蛋白峰强度比较(±s)

表1 各组差异蛋白峰强度比较(±s)

注：P1为鳞癌组与对照组比较的P值;P2为腺癌组与对照组比较的P值;P3为鳞癌组与腺癌组比较的P值

组别 n 2 593 Da 3 285 Da 6 625 Da 6 646 Da 9 257 Da鳞癌组 120 10.77±10.58 10.42±9.49 36.80±19.62 24.89±16.99 41.75±20.42腺癌组 82 17.63±10.65 18.35±11.73 25.03±12.21 13.91±6.91 31.82±13.19对照组 52 13.49±6.31 14.43±7.36 30.59±11.27 17.68±6.82 35.35±8.57 F值 20.706 27.164 12.035 19.882 8.441 P值 1.46×10-6 7.49×10-7 8.19×10-6 6.92×10-7 1.50×10-4 P1值 0.046 0.041 0.037 0.002 0.040 P2值 0.000 0.000 0.019 0.031 0.039 P3值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 差异蛋白质峰的初步鉴定 搜索Swiss-Prot数据库,5个特征蛋白的初步溯源情况是2 953为Coenzyme PQQ synthesis protein A;3 285为Uncharacterized protein HI1192;6 625为50S ribosomal protein L30;6 646为UPF0434 protein HEAR2489;9 257为30S ribosomal protein S17。

3 讨论

目前国内外对SELDI-TOF-MS技术用于检测肿瘤、心血管疾病、器官移植、感染等痕量蛋白标志物并用于早期诊断的研究均有报道[3～5]。蛋白芯片联合质谱技术使得SELDI-TOF-MS具有高灵敏度和高通量的检测性能,但由于受到多种因素和实验条件的影响,重现性较差[6]。本研究我们建立了标准分子的二维内标方法,提高了该技术相对分子质量和峰高度检测的重复性,保证了实验检测数据的准确性和可比性。

我们通过检测鳞癌组、腺癌组与对照组血清蛋白指纹图谱,共筛选出 83个差异表达的蛋白质荷比峰,筛选出其中 5个表达差异最明显的蛋白质峰,其m/z及各组峰强度 F检验结果表明,所挑选的峰的确为三组间有差异的蛋白峰,而不是系统误差等非分析因素所造成的差异。两两比较 P均 ＜0.05,说明这五个差异蛋白质峰在鳞癌组与对照组、腺癌组和对照组以及鳞癌组和腺癌组间亦有明显差异。此预示在癌症的发生、发展过程中,总会有癌基因或抑癌基因调控表达生成的相关蛋白的表达异常(增高或降低),从另外一个角度来看,即使是同一种癌症,不同的组织来源和病理分型亦会有不同的蛋白表达异常,而恰恰是这些蛋白表达的差异为临床医生对肿瘤的诊断和分型、分期提供进一步的依据,且可以对肿瘤的基因组和蛋白质组学的研究提供全新思路。

我们对鳞癌、腺癌的差异蛋白的统计分析表明这些蛋白质在病理分型上有不同表达,而这些不同表达所对应的具体蛋白种类甚至于基因种类是现今人类关注和研究的重点。当然这种横向研究的拓展并不否定纵向深入研究的重要性,Graddock等[7]利用SELDI-TOF-MS技术对精神分裂症进行研究,通过对比发现了3 374Da和3 450 Da这两个蛋白,经鉴定为 α防御素。找到疾病的差异蛋白后对其差异进行鉴定和分析的研究是比较蛋白组学研究中最重要、最热门的方向,这些纵向的研究为蛋白质乃至基因的研究提供了可靠数据。本研究我们通过搜索蛋白数据库对这些差异蛋白质峰进行了初步溯源,下一步的工作将是对这些初步溯源的蛋白质进行鉴定和验证。基于此,有关鳞癌、腺癌的蛋白组学研究可能对蛋白质的溯源提供新的思路。

[1]Thomas A,Sellers LN,John R,et al.Review of proteomics with applications to genetic Epidemiology[J].Genetic Epidem iology,2003, 24(2)：83-98.

[2]丁银环,胡琼英,梁双花,等.运用内标校准法提高表面增强激光解吸电离飞行时间质谱检测中的重复性[J].中华检验医学杂志,2009,32(3)：1-3.

[3]Lin YW,Lin CY,Lai HC,et al.Plasma proteomic pattern as biomarkers for ovarian cancer[J].Gynecol Cancer,2006,16(1)：139.

[4]Engwegen JY,Helgason HH,Cats A,et al.Identification of serumproteins discrim inating colorectal cancer patientsand healthy controls using surface-enhanced laser desorption ionisation-time offlightmass spectrometry[J].World JGastroenterol,2006,12(10)：1536-1544.

[5]Malik G,Rojahn E,Ward MD,et al.SELDIprotein profiling of dunning R-3327 derived cell lines：identification of molecular markers of prostate cancer progression[J].Prostate,2007,67(14)：1565-1575.

[6]郑艳颖,王雅杰,康熙雄.表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术的质量控制与标准化[J].中华检验医学杂志,2006,29 (1)：20-22.

[7]Craddock RM,Huang JT,Jackson E,et al.Increased Alpha Defensins as a Blood Marker for Schizophrenia Susceptibility[J].Mol Cell Proteom ics,2008,7(7)：1204-1213.