重组血管生成素-Ⅰ基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染和表达

胡占升,于学江

(辽宁医学院附属第一医院,辽宁锦州 121001)

血管生成素是机体信号转导途径中的重要因子,在调节血管网形成过程中起重要作用[1]。骨髓间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种,具有干细胞的多向分化特性,且无胚胎干细胞的伦理学争议,其本身不表达 MHC类抗原,具有“免疫逃避”机制,是作为同种异体移植的良好种子细胞[2]。2010年7月,我们将构建的pEGFP/Ang-Ⅰ真核表达载体用脂质体介导转染鼠 MSCs,旨在获得稳定表达Ang-Ⅰ的MSCs,为进一步观察其对急性肺损伤的保护作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 4周龄SD大鼠(辽宁医学院试验动物中心提供),雌雄不限。DMEM培养基(GIBCO公司),噻唑兰(MTT,南京百泰生物公司),pEGFP载体(辽宁医学院生化实验室提供),ELISA检测试剂盒(北京华美生物公司),感受态大肠杆菌DH5a、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和标准DNA分子Marker(Takara公司)。

1.2 Ang-Ⅰ基因型检测及PCR扩增 取正常新鲜胚盘组织,加入Trizol总RNA提取试剂,提取总RNA。用适量无RNase水溶解RNA,260 nm/280 nm比色定量,鉴定纯度。甲醛变性胶电泳鉴定RNA完整性。用Promega RT-RNA PCR试剂盒进行RT-PCR逆转录特异扩增人Ang-ⅠCDNA,人Ang-Ⅰ上游引物P1 1μl与下游引物P2 1μl混匀后行PCR反应。PCR产物用1%琼脂糖胶电泳分离,溴化乙锭(EB)染色,紫外灯观察结果,回收纯化。

1.3 pEGFP/Ang-Ⅰ表达载体的构建与鉴定 将目的基因和质粒pEGFP分别用XhoⅠ和BamhⅠ双酶切,电泳回收纯化后,再次混合,用T4DNA连接酶于16℃作用过夜。将连接产物转化 DH 5a,感受态细胞(制备参照《分子克隆》CaCl2进行)。铺LB-Amp培养基平板,于 37℃培养过夜。挑取阳性菌落,在LBA培养基中扩增后提取质粒。1%琼脂糖电泳分离,EB染色,紫外灯观察结果,回收纯化,送检一部分质粒,测序工作由北京三博远公司完成。

1.4 MSCs的原代培养 用密度离心法分离MSCs。颈椎脱臼处死SD大鼠,无菌条件下取双侧肱骨、股骨,PBS漂洗,剪去骨两端,暴露骨髓腔,用DMEM低糖完全培养基冲洗,吹打分散细胞,过 200目筛网,用等体积PBS稀释骨髓,轻轻置于1.077 g/m l Ficoll液上,2 500 r/min离心10 min,取中间单个核细胞层。调整细胞密度为 1×106/m l,接种培养瓶,置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养。24 h后换液,去除未贴壁细胞,以后每隔 72 h换液。细胞约90%融合时用 0.25%胰蛋白酶消化传代,1∶2接种于新培养瓶中,传三代后鉴定并用于以后实验[3]。

1.5 pEGFP/Ang-Ⅰ质粒转染MSCs pEGFP/Ang-Ⅰ及空载体pEGFP各10μg,分别与80μl MSCs细胞混匀,转入0.2 cm电转杯,冰浴5min,于Bio Rad Gene Pulse R电转仪1 500 V,25μf,200Ω条件下转化,电击结束后,立即加入1ml 0℃1mol/L的山梨醇,混匀。取0.3m l转化物转移到25 cm2的培养瓶中,加入L-DMEM完全培养基,37℃、5%CO2培养[4]。

1.6 筛选稳定表达的MSCs及表达产物Ang-Ⅰ蛋白的鉴定 将转移到培养瓶中的细胞加入 G418 (0.4 mg/ml),持续培养30～45 d,筛选稳定表达Ang-Ⅰ的MSCs。筛选完毕后,按照Invitrogen公司提供的方法,提取高 G418抗性且生长良好的细胞总DNA,用PCR检测Ang-Ⅰ基因与MSCs染色体基因组的整合,同时用pEGFP/Ang-Ⅰ质粒DNA和pEGFP空质粒转化的MSCs总DNA。在相同条件下,分别做阳性和阴性对照,琼脂糖电泳分离,EB染色,观察结果。取培养液,Western blot法检测Ang-Ⅰ蛋白的表达。取经纯化的Ang-Ⅰ蛋白,以Ang-Ⅰ蛋白的抗体作为第一抗体,进行免疫印迹检测。

2 结果

2.1 质粒酶切鉴定构建的质粒 用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后,得到 5 800和420 bp 2个片段,与预期完全相同,再经PCR鉴定正确(见图 1)后行测序鉴定,测序结果正确,证明所构建的质粒为pEGFP/Ang-Ⅰ重组质粒。

2.2 筛选稳定表达的MSCs及表达产物Ang-Ⅰ蛋白的鉴定 加入G418培养20 d后,MSCs细胞数量趋于稳定,存活下来的细胞基本为转染进去重组质粒的阳性细胞,细胞对 G418已产生较强的耐受性[5]。pEGFP/Ang-Ⅰ转染MSCs后,筛选第2及12代时收集转基因MSCs培养上清,Western blot法检测结果示 Ang-Ⅰ蛋白有较高水平的表达。免疫印迹检测结果表明,Ang-Ⅰ蛋白在相对分子质量 14 kD处能与Ang-Ⅰ蛋白的抗体发生特异性反应,重组Ang-Ⅰ蛋白得到表达。

图1 PCR法验证Ang-Ⅰ基因电泳图

3 讨论

近年来研究发现,Ang-Ⅰ可有效抑制新生血管形成、促进血管成熟、抑制血管渗漏;还可抵御用于芥子油引起的炎症渗出,对减少血管渗漏和淋巴管的稳定性有很大作用,我们推测其可能在急性肺损伤治疗中起关键的保护作用[6]。急性肺损伤的病理特点是肺泡毛细血管屏障的破坏和肺泡蛋白质渗出产生的肺水肿,目前治疗尚未得到满意效果[7]。最新研究发现,血管生成素在急性肺损伤中有重要作用,为进一步明确其实际作用,本实验选择电转化介导的重组真核表达质粒pEGFP-Ang-Ⅰ转染大鼠骨髓基质细胞,使 Ang-Ⅰ在细胞内产生高效、稳定的暂时表达,从而为进一步用基因治疗技术治疗急性肺损伤的实验打下良好基础。本实验在电转化介导下将pEGFP-Ang-Ⅰ基因转染大鼠骨髓基质细胞,通过免疫组化证实转染后经 G418筛选培养至约 3周后,在蛋白水平上产生了 Ang-Ⅰ蛋白的稳定表达,证实了表达载体pEGFP-Ang-Ⅰ的有效性。

急性肺损伤的发生有其自身特点,单纯抑制生长因子(如血管内皮生长因子)或炎症因子(白细胞介素等)并不能根本缓解急性肺损伤的呼吸功能损失。抑制血管渗漏、促进新生血管成熟、抗炎症将会成为急性肺损伤未来研究的重点[8]。本研究我们应用MSCs表达Ang-Ⅰ,且克隆出人的Ang-Ⅰ基因全部外显子,得到了全长的Ang-Ⅰ蛋白,最大限度保证了Ang-Ⅰ的生物活性;为急性肺损伤的治疗提供了一种全新思路,将有助于提高重症患者的抢救成功率。

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