BN大鼠玻璃体内注射曲安奈德抑制脉络膜新生血管生长△

高小燕 何守志

许多脉络膜视网膜疾病,如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和中心性渗出性脉络膜视网膜病变等,都可以导致脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成,引起不可逆性中心视力损害。近来,人们做了很多关于CNV的临床和实验研究,尚未发现明确的治疗方法。目前主要的治疗方法有激光光凝、玻璃体切割、放射治疗等,但这些方法不可避免地具有潜在的损害健康组织的危险[1]。曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)是一种合成的皮质类固醇类药物,它的主要药理作用是抗炎和免疫抑制。TA和其他的类固醇药物是已知的在动物模型中能有效抑制新生血管生成的药物[2]。本实验主要研究玻璃体内注射 TA抑制CNV形成和发展的作用和机制,为临床治疗CNV提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器设备和主要药品试剂 氪激光机(美国Coherent公司,型号Novua 2000);FFA摄像机(德国Heideberg公司);Image-ProPlus 5.1图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)。40 g·L-1TA注射液(昆明积大制药有限公司);兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、复合消化液6 mL、ICAM-1原位杂交检测试剂盒、0.01 mol·L-1枸橼酸盐缓冲液(武汉博士德生物工程有限公司);AEC显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BN大鼠CNV模型的建立 36只健康雄性棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠(中国医学科学院实验动物中心提供),系清洁级动物,体质量 200～220 g。随机分为 TA组和对照组,每组 18只,随机选取一眼进行实验。5 g·L-1复方托品酰胺眼液滴双眼散瞳,左下腹腔内注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3.0 mL·kg-1)麻醉,检查双眼前节和眼底均正常。滴 10 g·L-1甲基纤维素后,参照赵世红等[3]的方法建立CNV动物模型,TA组大鼠眼前放置-53 D接触镜,氪激光(647 nm)围绕视盘等距离光凝视网膜20点。激光参数:功率360 mW,光斑直径100 μm,曝光时间0.05 s。

1.2.2 药物应用 光凝后即刻在全身麻醉状态下,用10 g·L-1丁卡因滴眼液行表面麻醉,手术显微镜下,30 G针头颞侧角膜缘后0.5mm作一穿刺口,微量注射器从穿刺口进针,深度约为 1.5 mm,针尖朝向视神经方向,玻璃体中可见针尖,缓缓注入TA 8 μL,由散大的瞳孔可观察到玻璃体中 TA的白色混悬液,轻轻拔针后,显微镊子轻夹穿刺口片刻,以利于穿刺口闭合。对照组 BN大鼠玻璃体内注射同等容量的等渗BSS液。因注射造成晶状体损伤眼均排除实验。每组光凝后 1周、2周、4周各选择 6只大鼠进行实验。

1.2.3 FFA检查 在视网膜光凝后2周、4周,各选取 6只大鼠进行麻醉、散瞳,腹腔内注射 100 g· L-1荧光素钠0.3 m L,行FFA检查。每个时间点选取6张FFA图像,进行IOD值计算,取其平均值。

1.2.4 病理标本的制作 FFA检查后,分别在光凝后 1周、2周、4周时,每个时间点深度麻醉下各摘除6只BN大鼠的眼球,用DEPC处理过的蒸馏水冲洗,置于40 g·L-1多聚甲醛+0.1 mol·L-1PBSDEPC液中固定2 h。梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋,蜡块4℃保存备用。眼球组织 5μm厚度连续切片,置于50℃DEPC处理过的蒸馏水中展片,捞片,置烤箱37℃烤片12 h后,4℃保存,备用做 HE染色,400倍光镜下观察细胞浸润情况及 CNV生长情况,测量CNV面积,免疫组织化学检测ICAM-1的蛋白表达情况及原位杂交检测ICAM-1mRNA的转录情况。

1.2.5 ICAM-1蛋白的免疫组织化学检测 石蜡切片常规脱蜡至水;体积分数3%H2O2室温孵育 10 min,阻断内源性过氧化物酶活性,蒸馏水冲洗,0.01 mol·L-1PBS液浸泡5min;切片置于含0.01 mol· L-1枸橼酸盐缓冲液的抗原修复盒中,置于微波炉中微波中火加热15 min进行抗原热修复,滴加一抗兔抗大鼠ICAM-1(体积比为1∶70),4℃过夜,0.01 mol·L-1PBS液洗涤;滴加生物素化山羊抗兔IgG (二抗),37℃孵育20 min,0.01 mol·L-1PBS液洗涤;滴加SABC,37℃孵育20 min,0.01 mol·L-1PBS液洗涤;滴加AEC,室温显色,镜下控制反应时间为3～10 m in,蒸馏水充分洗涤;苏木素轻度衬染10 s,自来水充分水洗,水溶性封片剂封片。0.01 mol·L-1PBS液取代一抗孵育,作为阴性对照,试剂盒中已知阳性切片作为阳性对照。切片内被染成红色的点、团簇为阳性反应物。400倍光镜下,选取每个眼球连续切片中含有最大CNV直径的切片,对每张切片的ICAM-1蛋白表达的免疫着色IOD值进行测量,取5张切片的平均IOD值作为每个标本的观察值。

1.2.6 ICAM-1 m RNA的原位杂交检测 石蜡切片常规脱蜡至DEPC-H2O;体积分数3%H2O2室温孵育10 min,灭活内源性酶,蒸馏水洗3次;根据试剂盒说明暴露mRNA片段、后固定、预杂交、杂交:滴加含ICAM-1寡核苷酸标记探针的杂交液20μL,原位杂交专用盖玻片盖在玻片上,置于湿盒中 42℃杂交18 h;滴加封闭液37℃反应30 min;滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃孵育1 h;滴加SABC 37℃孵育30min;生物素化过氧化物酶37℃孵育20m in;AEC室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤;苏木素复染20 s,充分水洗,GVA水溶性封片剂封片。切片中呈团簇、点状的红色着色为阳性。用不含探针的杂交液进行杂交作为阴性对照,试剂盒中已知阳性切片作为阳性对照。400倍光镜下,选取每个眼球连续切片中含有最大CNV直径的切片,对每张切片的ICAM-1mRNA阳性着色的IOD值进行测量,取5张切片的平均IOD值作为每个标本的观察值。

1.3 图像分析与数据处理 应用Image-Pro Plus 5.1图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)对ICAM-1蛋白表达的阳性着色、ICAM-1mRNA的阳性着色、CNV的面积、FFA检测的IOD值进行半定量分析。

1.4 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理,数据资料以s表示,不同时间点组内差异的显著性用单因素方差分析,组内两两比较用SNK检验,同一时间的组间比较用Student t检验,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光凝后4周内CNV情况 光凝后4周内,TA组病理组织切片可见纤维血管膜增殖(fibrovascular proliferation,FVP)形成不明显,光凝处视网膜外层断裂,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞和Bruch膜缺失,少量红细胞、炎性细胞浸润在激光斑处,视网膜被拉向缺失区,在RPE细胞和Bruch膜的缺失处可见到明显的巩膜,CNV形成不明显。对照组可见清晰的FVP形成,CNV随时间增长而增厚,CNV中包含胶原组织和管腔中含有红细胞的增殖血管,炎性细胞浸润较TA组明显,主要是巨噬细胞的浸润(图1)。光凝后4周内CNV面积变化见表1。TA组CNV面积随时间增长呈增加趋势,与对照组相比差异均有统计学意义(均为 P＜0.05)。

Figure 1 Situation of CNV at 4weeks after photocoagulation(HE,× 400).A:Unobvious formation of CNV in TA group;B:CNV became thicker in control group 光凝后4周,CNV情况(HE,×400)。A:TA组CNV形成不明显;B:对照组可见明显CNV形成

2.2 FFA检查 光凝后4周内FFA检查结果见表1。光凝后 4周时,TA组荧光渗漏较 2周时增加,其IOD值比较差异有统计学意义(P＜0.05)。TA组渗漏边界较清,荧光强度低,其IOD值与对照组相比差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。

表1 CNV面积和FFA检查结果在4周内的变化Tab le 1 Change of CNV area and FFA(IOD)in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

表1 CNV面积和FFA检查结果在4周内的变化Tab le 1 Change of CNV area and FFA(IOD)in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

Note:Comparedwith the former time pointin the samegroup,*P＜0.05;Compared with the control group at the same time,△P＜0.05

1 week 1 896.30±323.54△ 3 244.28±592.35 - -2 weeks 2 178.39±802.87*△4 485.99±487.77*241.52±33.88△ 542.55±33.99 4 weeks 3 233.16±632.81*△6 231.01±226.25*310.27±39.83*△712.59±39.64*

2.3 光凝后4周内ICAM-1 m RNA和ICAM-1蛋白的表达 光凝后4周内ICAM-1 mRNA转录和ICAM-1蛋白的表达见表 2。光凝后4周内,TA组ICAM-1mRNA的转录随CNV生长略有增加,但组内IOD值比较差异无统计学意义(P＞0.05);ICAM-1 mRNA在TA组中的转录远远低于对照组,同一时间点2组间IOD值相比差异均有统计学意义(均为P＜0.05)。TA组可见光凝处视网膜外层断裂,RPE细胞层断裂,细胞排列紊乱,FVP不明显,表现为微量的ICAM-1mRNA表达;对照组ICAM-1mRNA表达呈强阳性(图2)。

ICAM-1免疫组织化学检测结果显示,在 4周内,TA组ICAM-1蛋白表达随CNV生长而逐渐增强(均为P＜0.05),但远远低于同时期的对照组(均为P＜0.05,图3)。

表2 ICAM-1 mRNA和ICAM-1蛋白的IOD值在4周内的表达Table 2 Change of IOD value of ICAM-1 mRNA and protein in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

表2 ICAM-1 mRNA和ICAM-1蛋白的IOD值在4周内的表达Table 2 Change of IOD value of ICAM-1 mRNA and protein in 4 weeks after photocoagulation (s,n=6)

Note:Compared with the former time point in the samegroup,*P＜0.05;Compared with the controlgroup at the same time,△P＜0.05

Time IOD valueof ICAM-1m RNA IOD value of ICAM-1 protein TA group Control group TA group Control group 1week 5.49±1.59△ 8.52±1.09 6.46±2.75△ 15.53±3.02 2weeks 7.04±1.70△ 20.36±1.82* 13.39±4.18*△ 44.91±5.02* 4weeks 7.66±0.48△ 48.49±2.05* 35.47±7.62*△ 123.29±7.77*

Figure 2 Weakly positive expression of ICAM-1 mRNA in TA group(A)at 4weeksafter photocoagulation;Strongly positive expression in control group(B)(HE,×400) 光凝后4周,ICAM-1 mRNA在TA组(A)中弱阳性表达;在对照组(B)中呈强阳性表达(HE,×400)

Figure 3 Protein expression of ICAM-1 protein at 4 weeks after photocoagulation(HE,×400).A:Weakly positive expression in TA group;B:Strongly positive expression in control group 光凝后4周,ICAM-1蛋白表达(HE,×400)。A:TA组呈弱阳性表达;B:对照组呈强阳性表达

3 讨论

CNV是许多脉络膜视网膜疾病的最终结局,可导致不可逆性的中心视力损害,是一个较难治疗的疾病,大部分是和AMD、中心性渗出性脉络膜视网膜病变相关,目前的治疗方法均为 CNV形成后的对症治疗。治疗CNV的关键在于阻断其发展过程,而药物治疗是最有希望阻断病变发展进程的方法,早期使用抗血管生成药物来控制CNV的发生、发展逐渐受到重视,如应用皮质类固醇[2]等。TA为合成的皮质类固醇类药物,又称丙酮氟羟泼尼松龙、丙酮去炎松或去炎松 A等,为不溶于水的白色或类白色结晶状粉末,临床常用其醋酸酯,注射剂为微细颗粒的混悬液。

本实验采用玻璃体内注射 TA的方法观察其对BN大鼠CNV的治疗效果。注射药物在手术显微镜下进行,避免因注射造成晶状体损伤。药物在大鼠玻璃体内的药物代谢动力学未知,据大鼠的简化眼模型可知玻璃体的平均容积为 56μL[4],故玻璃体内注射40 g·L-1TA 8μL,最终的药物浓度为5.7 g· L-1,比在临床中用在人眼中的浓度(1 g·L-1)高5倍多,避免了实验中药物用量不足,且该剂量相对于大鼠的玻璃体容积是可以施行的。对照组注射同等容量的等渗BSS液,避免了由穿刺操作造成的物理影响,或者是由液体注入造成的眼压改变导致的实验结果改变,保证了实验结果的可靠性。

本实验采用BN大鼠光凝后即刻玻璃体内注射TA,光凝后2周和4周分别行FFA检查,结果显示TA组在4周时荧光渗漏较2周时增加,其IOD值比较差异有统计学意义,但其 IOD值增加不能排除与激光斑萎缩引起浓厚的组织着染有关;且光凝后2周、4周时IOD值较对照组明显降低,显示CNV的形成和生长明显受到抑制。光镜下观察,光凝后 1周、2周和4周时TA组CNV面积略增加,但明显低于同时期的对照组,证实了本实验光凝后即刻玻璃体内注射TA 8μL能显著抑制新生血管形成和发展。这与Ciulla等[2]的结论一致,他们认为TA可能是通过抑制白细胞和巨噬细胞释放血管形成因子而发挥抑制CNV的作用。

TA治疗CNV的机制尚不完全清楚。本实验通过免疫组织化学及原位杂交的方法,发现光凝后 4周内ICAM-1mRNA及其蛋白的表达随CNV生长而逐渐增强;TA可以降低BN大鼠激光斑损伤区中的ICAM-1mRNA和ICAM-1蛋白的表达,从而抑制激光斑损伤处的炎症反应,达到治疗效果。说明该细胞因子可能通过多种不同的机制参与CNV的生长。很久以来,皮质类固醇激素就被认为具有抗血管生成特性,它通过改变细胞外基质的降解和抑制白细胞释放血管生长因子而发挥作用。以往也有研究证实TA可以影响血管内皮细胞外基质的更新[2]和 RPE细胞反应,包括增加血-视网膜屏障的功能和下调VEGF基因的表达[5]。Penfold等[5]发现玻璃体内注射TA可影响ICAM-1表达,下调炎症标记物。还有学者发现通过抑制炎症细胞因子如VEGF、ICAM-1和MCP-1等的表达,可防止眼内新生血管形成和炎症反应[6]。亦有学者研究发现,在小鼠的CNV组织中ICAM-1表达呈强阳性[7],而在PDT治疗后人眼的 CNV膜上的ICAM-1表达随治疗次数增加而下降[8]。我们发现在视网膜光凝后即刻玻璃体内注射TA可以显著降低ICAM-1mRNA转录和ICAM-1蛋白的表达,CNV面积明显减小。皮质类固醇的一个重要作用即抗炎,炎症是参与CNV形成的重要发病机制[9-10],因此,TA可能通过抗炎作用在CNV中发挥有效的治疗作用。

近来,人们在临床上已采取单独使用TA玻璃体内注射或将其做为其他疗法的辅助疗法治疗CNV,取得了一定疗效[9,11-12]。此外,有临床资料表明 TA治疗CNV除抑制新生血管的生长外,还能够改善视力[5,13],为其治疗 CNV的可行性提供了科学根据。但是不容忽视的是 TA玻璃体内注射产生的一些并发症,一是由注射过程中操作不慎所致,如感染、玻璃体内出血等;二是由药物本身可能的毒性作用引起,如眼压升高[13]、白内障、视网膜脱离及视网膜毒性反应等。TA的给药剂量、适应证、药剂剂型、是否需要重复给药、远期效果及并发症等仍需进一步研究证实,其生物学效应仍需进行更为深入的研究。

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