赤雹根总皂苷对佐剂性关节炎大鼠脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞的影响

陈建双，张玉玲，李莎莎，佟继铭，刘永平

(承德医学院，河北承德067000)

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、全身性、自身免疫性疾病，以多关节疼痛、肿胀和功能障碍为主要特征，目前尚无有效控制疾病发展的理想药物。赤雹根总皂苷(SRTD)为满药赤雹成熟干燥块根的正丁醇萃取物，是赤雹根的主要有效成分之一，有明显的镇痛作用［1］，但其能否用于RA的治疗目前未见报道。我们于2009年1月～2010年2月进行本研究，拟探讨SRTD对佐剂性关节炎(AA)大鼠的治疗作用机制，为赤雹根的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体质量160～180 g，购自河北医科大学实验动物中心。

1．2 药品与试剂 SRTD由承德医学院中药研究所药理毒理研究室制备;弗氏不完全佐剂(FIA)、脂多糖(LPS)、刀豆蛋白 A(ConA)、MTT，美国 Sigma公司;卡介苗(BCG)，卫生部北京生物制品研究所;IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒，武汉博士德生物科技有限公司;RPMI 1640干粉，Gibco公司;胎牛血清，杭州四季青公司;淋巴细胞分离液，中国医学科学院生物工程研究所。

1．3 AA模型制备及分组 取大鼠80只，随机取10只作为正常对照组(NC组)，注射等体积蒸馏水。其余70只大鼠每只右后足跖皮内注射0．1 ml弗氏完全佐剂(FCA，BCG浓度为12 mg/ml)，以注射点周围出现明显的突起白泡为佳。致炎后第18天采用关节炎分数评分法计算关节炎指数(AI)值［2］，AI值≥6为造模成功的标准。本组大鼠成模率为75．7%(53/70)。将造模成功的53只大鼠随机分为模型组(Model组)，SRTD 160、80、40 mg/(kg·d)组和雷公藤12 mg/(kg·d)组(TP组)，每组10只，各组大鼠连续灌胃给药21 d，给药量为10 ml/(kg·d)，NC组和 Model组灌胃给予等体积的SRTD溶剂蒸馏水。剩余3只不做任何处置，观察其自然病程。

1．4 脾淋巴细胞增殖反应测定 用药后第22天，颈椎脱臼处死大鼠，常规方法制备大鼠脾淋巴细胞悬液，将细胞悬浮于RPMI 1640完全培养液中，用台盼蓝染色计数活细胞数在95%以上后，调整细胞浓度为2×106/ml。于96孔培养板中每孔加入细胞悬液200 μl，每一样品加6 孔，其中3 孔各加10 μl ConA液作为平行试验孔，另3孔作为对照孔，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养72 h。于培养结束前4 h 每孔轻轻吸去上清液 150 μl，补加 150 μl不含血清的RPMI 1640培养液，同时加入5 mg/ml的MTT溶液10 μl，于振荡器上混匀后置37℃ 5%CO2培养箱内继续培养5 h。取出培养板，每孔加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)，置振荡器上混匀后静置20 min，使紫色结晶完全溶解，取上清液150 μl于96孔细胞培养板中，570 nm处用酶标仪测OD值，计算脾细胞增殖指数(PI)。PI=(实验孔OD值－对照孔OD值)/对照孔OD值。

1．5 腹腔巨噬细胞(PMΦ)IL-1β、TNF-α 的诱生与检测 用药后第22天，颈椎脱臼处死大鼠，常规方法制备大鼠PMΦ悬液，用RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2×106/ml。取细胞悬液于24孔培养板中，每孔1 ml。置CO2培养箱中，37℃培养2～3 h，使PMΦ贴壁。取出培养板弃去上清，用RPMI 1640洗涤培养板3遍即得巨噬细胞单层。于单层巨噬细胞孔中加入LPS(20 μg/ml)1 ml。置CO2培养箱中，37℃培养24 h，收集上清液过滤除菌，－20℃保存，采用双抗夹心ABC-ELISA法测定IL-1β、TNF-α 含量。

2 结果

2．1 脾淋巴细胞增殖结果 NC组、Model组、160 mg/(kg·d)SRTD 组、80 mg/(kg·d)SRTD 组、40 mg/(kg·d)SRTD组、TP组大鼠PI值分别为0．23±0．03、0．87 ± 0．01、0．34 ± 0．03、0．53 ± 0．02、0．60 ±0．02、0．23 ±0．02，各组与 Model组比较 P 均 ＜0．01。

2．2 IL-1β、TNF-α 检测结果 NC 组、Model组、160 mg/(kg·d)SRTD 组、80 mg/(kg·d)SRTD 组、40 mg/(kg·d)SRTD组、TP组大鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1β 分别为(0．09 ±0．02)、(0．41 ±0．03)、(0．11 ±0．02)、(0．15 ±0．02)、(0．22 ±0．02)、(0．13 ±0．03)ng/ml，各组与 Model组比较 P 均 ＜0．01;产生 TNF-α分别为(0．17 ±0．01)、(1．24 ±0．06)、(0．18 ±0．01)、(0．26 ±0．01)、(0．32 ±0．01)、(0．20 ±0．01)ng/ml，各组与Model组比较P均＜0．01。

3 讨论

AA为免疫性炎症模型，是筛选和研究治疗RA药物常用的模型之一［7］，其组织病理学变化和发病机制与人类RA相似。前期实验证实，SRTD能明显改善大鼠的多关节炎症状，使动物活动增多、关节肿胀度和AI显著下降，提示SRTD对RA有一定的治疗作用。

细胞免疫功能紊乱是AA大鼠免疫功能异常的重要特征之一。ConA作为多克隆刺激剂可选择性刺激T细胞增殖。实验结果显示，AA模型组大鼠PI明显高于正常对照组，与文献报道一致［3］。SRTD对AA大鼠过度增强的脾T淋巴细胞增殖有明显抑制作用，提示SRTD对大鼠AA的治疗作用与抑制T淋巴细胞增殖有关。

细胞因子网络失衡，促炎因子(IL-1、IL-6、TNF-α)增多，抗炎因子(IL-10)减少，在RA的发病中亦起着非常重要的作用［4］。IL-1β、TNF-α 均是 RA 的促炎细胞因子，IL-1与TNF-α有许多相似的促炎症作用而被称为“姊妹细胞因子”［5］，且均与RA疾病活动相关。IL-1能促进体内淋巴细胞和骨关节滑膜细胞的增殖和分化、促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素PGE2和胶原酶［6］，后者可进一步引发滑膜的炎症反应，造成软骨基质的崩解，抑制糖蛋白及骨的合成，造成关节损伤。而局部免疫复合物、游离胶原等分解产物刺激 IL-1合成，这样就形成恶性循环。IL-1还可刺激B型滑膜细胞产生高水平的基质金属蛋白酶，降解大多数的细胞外基质成分，加快RA的破坏性进程。TNF-α具有许多与IL-1相似的作用，可刺激滑膜细胞和软骨细胞合成PGE2和胶原酶，引起骨和软骨的吸收破坏，促进成纤维母细胞的增生。TNF-α在活动性 RA中还可提高血小板的活性和聚集。

文献报道在 RA患者的滑液和血清中 IL-1、TNF-α水平均明显增高［7］。本研究结果表明，AA大鼠腹腔巨噬细胞经LPS诱导产生的IL-1β、TNF-α含量明显升高，不同剂量的SRTD可不同程度下调促炎细胞因子水平以恢复细胞因子的网络平衡，这可能是SRTD治疗RA的机制之一。

［1］张玉玲，赵波，陈建双，等．赤雹根镇痛作用及有效部位研究［J］．时针国医国药，2010，21(10):2483-2484．

［2］佟丽，辛增辉，陈育尧，等．Mtb诱导的SD大鼠类风湿关节炎模型的建立及评价［J］．中国药理学通报，2009，25(2):259-263．

［4］田俊阁，卢伟伟，平立峰．中药对佐剂性关节炎大鼠细胞因子影响的研究进展［J］．现代中西医结合杂志，2009，18(30):3774-3776．

［5］李慧玲，邬剑，斗章，等．佐剂性关节炎大鼠细胞免疫功能的变化［J］．黑龙江医药科学，2011，34(2):82．

［6］Feldmann M，Brennan FM，Foxwell BM，et al．The role of TNF-alpha and IL-1 in the rheumatoid arthritis［J］．Curr Dir Autoimmun，2001，3(1):188-199．

［7］肖金鱼，王炳胜，王书杰．IL-1及TNF-α在关节炎大鼠模型血清中表达的实验研究［J］．中国中医急症，2011，20(4):607-608．