牛膝多糖对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的影响

杨旭东 张 杰 包海花

糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的主要慢性并发症之一，也是常见的视网膜血管病，其发病机制尚不十分明了。细胞凋亡在DR发生发展中的作用已逐渐受到大家的重视。牛膝系苋科牛膝属植物，入肝、肾经，具有补肝肾、强筋骨、引血下行之功效。现代药学研究认为牛膝具有降血糖、利尿，以及抗肿瘤和增强免疫功能等多种药理作用〔1，2〕。本实验对牛膝多糖对糖尿病大鼠视网膜病变的保护作用及其机制进行了初步研究，为临床应用牛膝多糖治疗糖尿病视网膜病变提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：鼠龄为6周的普通级Wsitar大鼠50只，雄性，200～250 g（动物合格证号：SYXK 黑 2006-033），由哈尔滨医科大学动物中心提供。

1.1.2 试剂：RT-PCR试剂盒，大连德宝生物有限公司；链脲佐菌素（streptozocin，STZ），美国 Sigma 公司；牛膝多糖（achyranthes bidentata blume polysaccharides，ABPS）由牡丹江医学院中心实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组：随机选取10只Wsitar大鼠作为正常对照组（A组），予基础饲料。其余40只制作糖尿病大鼠模型：以高热量饮食喂养8周后，尾静脉注射 STZ（15 mg/kg），48 h后检测空腹血糖，血糖在11.1～33.3 mmol/L（不含 33.3 mmol/L），且伴有糖耐量减退者即为造模成功。A组基础饲料饲养8周后，注射与STZ（15 mg/kg）同体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。造模成功的40只大鼠随机分为4组，每组10只：糖尿病模型组（B 组）、ABPS高剂量组（C 组）、ABPS中剂量组（D组）、ABPS低剂量组（E组）。造模成功后48 h，B组给予生理盐水灌胃，C、D、E组给予不同剂量 ABPS 灌胃治疗，给药剂量分别为300mg·kg-1·d-1、200mg·kg-1·d-1和 100mg·kg-1·d-1。 给药治疗 12 周后，取材处死。

1.2.2 标本制作：10%水合氯醛0.3 ml/100 g左下腹腔注射使大鼠麻醉，迅速分离眼球，剪断视神经，摘除双侧眼球，迅速将眼球壁用针头固定在冰台上，在显微镜下取出双眼视网膜，将同1只大鼠2眼视网膜合一，编号，置于-70℃冰箱保存，用于RT-PCR及DNA ladder检测。

1.2.3 DNA ladder检测视网膜组织细胞凋亡：取冻存视网膜组织磨成粉末，加50 μl细胞裂解液，37℃水浴过夜后，室温下以12 000 r/min离心5 min，将上清液移至另一微量离心管。用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液（体积比25∶24∶1）和氯仿各抽提1次。在上清液中加入1/10体积3 mol/L的醋酸钠和2倍体积的冷乙醇，-20℃沉淀过夜，4℃下以12 000 r/min离心10 min，弃上清液。晾干，加20 μl TE缓冲液，1 μl RNA 酶，37℃下放置 1 h，加 4 μl样品缓冲液，混匀，加到1.8%的琼脂糖凝胶样品孔中，电压2 V/cm，电泳 1～2 h。

1.2.4 RT-PCR测定视网膜组织survivin、bax mRNA表达：设计引物如下：survivin 引物，上游：5′-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3′； 下游：5′-AGCCAGTC CCCCACAGCAT-3′，扩增片段 329 bp。 bax 引物，上游：5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′；下游：5′-GGAAGTCCAATGTCCAGC-3′，扩增片段 345 bp。βactin 上游引物：5′-TTGCCTCTCAGACAATGCCTG-3；下游引物：5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′，扩增片段280 bp。反应条件为：95℃预变性2 min，94℃45 s，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35个循环，72℃复性5 min。经凝胶成像系统分析，分别计算survivin、bax 与内参（β-actin）扩增带荧光强度×面积的比值，得出survivin、bax mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般情况及症状比较

正常对照组大鼠精神状态良好，体重逐渐增加，饮食、饮水量正常。模型组大鼠一般状况较差，日益消瘦，生长发育迟缓，体毛无光泽，脱毛，活动频度增加，但反应迟钝，精神萎靡。造模4天即出现多饮、多食、尿量明显增多。ABPS各组大鼠精神状况、体重增长介于正常对照组和模型组之间，亦表现多饮、多食、多尿及消瘦的“三多一少”症状，后期经药物治疗症状明显缓解。

2.2 各组视网膜组织细胞凋亡情况

细胞发生凋亡后，电泳出现“梯状”图谱（ladder），与Marker相比，ladder中条带的bp数为 180-200bp的整倍数。正常对照组：DNA电泳后只出现1条距加样孔很近的大分子条带，电泳无ladder出现，所以发生凋亡的细胞数非常少。糖尿病模型组：DNA电泳后出现排列成梯状的数条条带（ladder），ladder颜色较深，发生凋亡细胞数明显增多。ABPS高、中剂量组：只出现1条距加样孔很近的大分子条带，电泳无ladder出现，发生凋亡的细胞数较少。ABPS低剂量组：出现较短的ladder，发生凋亡细胞数增多（图 1）。

图1 各组DNA ladder情况

2.3 各组大鼠视网膜组织bax、survivin表达

与糖尿病模型组比较，ABPS各组大鼠视网膜组织bax基因mRNA表达降低，survivin基因mRNA表达增加（P＜0.01）（表 1，图 2、图 3）。

表1 各组大鼠视网膜组织bax、survivin mRNA的表达情况（±s）

表1 各组大鼠视网膜组织bax、survivin mRNA的表达情况（±s）

注：①与正常对照组比较，P＜0.01；②与模型组比较，P＜0.01。

组别 n bax/β-Actin survivin/β-Actin A 10 0.12±0.01 0.48±0.04 B 10 0.58±0.04① 0.25±0.01①C 10 0.24±0.02①② 0.40±0.03①②D 10 0.39±0.03①② 0.33±0.03①②E 10 0.46±0.03①② 0.30±0.02①②

图2 各组细胞bax基因表达

图3 各组细胞survivin基因表达

3 讨论

糖尿病视网膜病变是糖尿病最主要的并发症之一，已有研究表明细胞凋亡与糖尿病视网膜病变密切相关。细胞凋亡是指有核细胞在生理条件下启动自身的遗传机制，主要通过内源性DNA内切酶的激活而发生自动死亡的过程。bcl基因家族是重要的凋亡调控基因，包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因如 bax、bak、bcl-xs等〔3〕。Bax 在多种细胞凋亡调控中发挥重要作用。Bax的促凋亡作用是通过与自身形成bax/bax同源二聚体的形式发挥的，Bax促进细胞凋亡的机制可能是与增高Caspase-3活性有关，Bax是 Caspase-3 活化的重要调节因子〔4〕。 Survivin 由 Altieri等〔5〕在 1997 年发现，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中一个成员，具有抑制细胞凋亡、促进细胞转化等作用，参与细胞的有丝分裂、血管的生成以及肿瘤细胞耐药性的产生，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。体外实验表明，Survivin与效应细胞死亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-7结合，抑制它们的活性和细胞凋亡〔6〕。

长期以来，一直认为视网膜细胞丧失是糖尿病最早的特征性改变，糖尿病视网膜细胞凋亡是糖尿病视网膜病变发生的核心机制之一〔7〕。但糖尿病视网膜细胞凋亡的分子生物学机制并未阐明。本实验发现ABPS具有抑制糖尿病大鼠视网膜组织细胞凋亡的作用，高剂量组效果最明显（P＜0.01）。为了进一步探讨其阻止凋亡的分子机制，我们通过RT-PCR的方法检测ABPS对视网膜细胞bax、survivin基因表达量的调节。实验结果显示ABPS能显著下调bax基因表达，上调survivin基因表达，高剂量组效果最显著（P＜0.01）。由此我们认为，ABPS通过调控bax、survivin基因表达，达到阻止糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的作用。

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