杞菊滴眼液治疗实验性干眼症泪液减少和角膜上皮病变

刘宏伟 彭淑玲 周 毅 张士贤 张海娟

干眼症是眼科门诊的常见病和多发病，临床上主要采用物理治疗、局部药物治疗、手术治疗和全身药物治疗等，一般来说不能将其治愈，只能缓解临床症状。杞菊地黄丸出自清代董西园的《医级宝鉴》，用于治疗肝肾阴不足引起的两眼昏花、视物模糊、眼睛干涩等，是在六味地黄丸的基础上加枸杞子和菊花2味中药而成。枸杞子和菊花有补肝肾，明目的作用。我们受此方剂的启发，研制出杞菊滴眼液，它由枸杞子、野菊花、黄精和薄荷脑4味药组成，我们对其促进家兔泪液分泌、减轻大鼠角膜损伤的作用进行实验研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

家兔20只，为新西兰兔，普通级动物，体重（2.1±0.3） kg，兔龄为 8 周，动物合格证号：SYXK（京）2006-0025。大鼠40只，为Wister大鼠，无特殊病原体级动物，体重（151±13） g，鼠龄为 6 周，动物合格证号：SYXK（京）2008-0021。均购自北京大学医学部实验动物科学部。

1.2 实验药品

1.2.1 实验药品：杞菊滴眼液、溶剂对照品（北京宏泰康达医药科技有限公司）；0.2%卡波姆滴眼液（博士伦公司）；0.5%羧甲基纤维素钠滴眼液（爱力根爱尔兰制药公司）；0.5 mg/ml阿托品注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；1%苯扎溴铵溶液（5%苯扎溴铵溶液加生理盐水稀释）、2%荧光素钠溶液（北京同仁医院）、0.4%盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天制药株式会社）。

1.2.2 杞菊滴眼液的制备：枸杞子、黄精加80%的乙醇回流2次，滤过；药渣与野菊花混合，加水浸泡24 h，煎煮3次，滤过，得药液一；另取薄荷脑、0.5 g吐温-80，加水适量，研磨使溶解，为药液二；将药液一、二混匀，加入0.02 g硫柳汞、0.1 mol/L氢氧化钠、磷酸盐缓冲液、8.5 g氯化钠，加水至1 000 ml，高压湿热灭菌，滤过，灌装，即得。

1.2.3 溶剂的制备：取0.5g吐温-80，加水适量，研磨，加入0.02 g硫柳汞、0.1 mol/L氢氧化钠、磷酸盐缓冲液、8.5 g氯化钠，加水至1 000 ml，高压湿热灭菌，滤过，灌装，即得。

1.3 实验材料

schirmer测定滤纸、无菌注射器、秒表（schirmer试验测定时间用）、手术镊、手术剪、裂隙灯显微镜。

1.4 观察杞菊滴眼液对干眼症家兔泪液分泌的影响

1.4.1 制作动物模型：参照Burgalassi泪腺注射阿托品的方法进行泪液分泌低下干眼症的造模〔1〕。20只家兔双眼滴0.4%盐酸奥布卡因滴眼液，下泪腺注射阿托品 0.25 ml/眼（0.5 mg/ml），0.5 小时后进行schirmer试验，结果较造模前减少（P＜0.05），说明造模成功。予每日双眼下泪腺注射阿托品4次，连续7天。

1.4.2 分组治疗：将20只家兔按第1次注射阿托品后schirmer试验结果分为5组，每组4只，使各组的schirmer试验值基本相同，分组后即刻进行治疗。5组分别为溶剂对照组（阴性对照）、卡波姆滴眼液组（阳性对照）、杞菊滴眼液低、中、高剂量组。分组后双眼即刻予相应滴眼剂。溶剂对照组予溶剂，4次/日；卡波姆滴眼液组予0.2%卡波姆滴眼液，2次/日；杞菊滴眼液低剂量组予杞菊滴眼液，2次/日；中剂量组予杞菊滴眼液，4次/日；高剂量组予杞菊滴眼液，8次/日。共治疗7天。

1.4.3 泪液分泌的测量：schirmer试验测定时间为2分钟。在造模前、第1次注射阿托品后0.5小时、第3、7天当日第 1次注射阿托品后 0.5小时进行schirmer试验。

1.5 观察杞菊滴眼液对干眼症大鼠角膜的作用

1.5.1 制作动物模型：用摘除泪腺、滴加苯扎溴铵溶液的方法制备大鼠角膜损伤干眼症模型。大鼠耳前皮肤去毛、消毒，滴0.4%盐酸奥布卡因滴眼液，用手术镊夹住耳前皮肤，手术剪在皮肤上剪一小口，剥离并摘除双侧泪腺〔2〕，双眼滴1%苯扎溴铵溶液，第2天观察角膜情况。

1.5.2 分组治疗：将40只大鼠根据角膜染色评分结果分为5组，每组8只，使各组的角膜染色评分值基本相同，5组分别为溶剂对照组（阴性对照）、羧甲基纤维素钠滴眼液组（阳性对照）、杞菊滴眼液低、中、高剂量组，双眼予相应滴眼剂治疗。其中羧甲基纤维素钠滴眼液组予0.5%羧甲基纤维素钠滴眼液，4次/日；其余4组用药情况同1.4.2。造模后第2天开始用药，治疗21天。

1.5.3 角膜荧光素染色检查及评分：大鼠双眼滴2%荧光素钠溶液，不冲洗，用裂隙灯显微镜进行观察。角膜上皮无染色，0分；染色面积＜25%，1分；染色面积为25%～50%，2分；染色面积为50%～75%，3分；染色面积＞75%，4分。在治疗第7、14和21天检查并记录角膜病变情况。

1.6 统计学方法

使用SPSS 11软件对数据进行统计学分析。结果数值以均数±标准差表示。家兔造模前、后schirmer试验结果比较采用t检验；各组家兔不同时期schirmer试验结果比较，以及各组大鼠不同时期角膜荧光素染色评分的比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 杞菊滴眼液对家兔泪液分泌的影响

造模前家兔的schirmer试验值为 （8.61±2.95）mm（n=40），第1次注射阿托品后0.5小时减少为（5.17±3.00）mm，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。schirmer试验值平均减少40.0%，说明泪腺注射阿托品可以抑制家兔泪液分泌。

家兔造模前及第1次注射阿托品后0.5小时，各组间的schirmer试验值差异均无统计学意义（P＞0.05）。治疗后第3天，卡波姆滴眼液组与溶剂对照组相比，Schirmer试验值增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；杞菊滴眼液各组与卡波姆滴眼液组间差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后第7天，杞菊滴眼液中、高剂量组Schirmer试验值均较溶剂对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；杞菊滴眼液各组与卡波姆滴眼液组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 各组干眼症家兔眼 Schirmer试验结果（mm，±s，n=8）

表1 各组干眼症家兔眼 Schirmer试验结果（mm，±s，n=8）

注：①造模前及第1次注射阿托品后，各组间比较，P＞0.05；②与溶剂对照组相比P＜0.05；③杞菊滴眼液各组与卡波姆滴眼液组相比，P＞0.05。

组别 造模前 第1次注射阿托品后 治疗3天 治疗7天溶剂对照组 8.40±3.67① 5.30±3.40① 3.45±2.25 3.40±2.07卡波姆滴眼液组 7.50±1.84① 5.35±1.75① 5.60±2.13② 6.40±2.41杞菊滴眼液低剂量组 8.00±2.00① 4.85±1.76① 5.20±2.54③ 6.30±1.89③杞菊滴眼液中剂量组 10.50±5.08① 5.35±4.44① 4.80±2.86③ 8.30±5.79②③杞菊滴眼液高剂量组 8.65±2.17① 5.00±3.66① 4.50±1.43③ 8.10±5.51②③

2.2 杞菊滴眼液对大鼠角膜的作用

治疗前及治疗7天，大鼠各组间角膜染色评分的差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗14天，杞菊滴眼液低、中、高剂量组的角膜染色评分显著低于溶剂对照组（P＜0.05）；杞菊滴眼液高剂量组角膜染色评分显著低于羧甲基纤维素钠滴眼液组（P＜0.05）；杞菊滴眼液低、中剂量组的角膜染色评分与羧甲基纤维素钠滴眼液组差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗21天，杞菊滴眼液低、中、高剂量组和羧甲基纤维素钠滴眼液组的角膜染色评分均低于溶剂对照组（P＜0.05），杞菊滴眼液各组与羧甲基纤维素钠滴眼液组差异无统计学意义（P＞0.05）（表 2）。

表2 大鼠角膜损伤修复的结果（±s，n=16）

表2 大鼠角膜损伤修复的结果（±s，n=16）

注：①各组间相比，P＞0.05；②与溶剂对照组相比，P＜0.05；③与羧甲基纤维素钠滴眼液组相比，P＜0.05；④与羧甲基纤维素钠滴眼液组相比，P＞0.05。

组别 治疗前 治疗7天 治疗14天 治疗21天溶剂对照组 3.13±1.36① 2.00±1.03① 2.06±0.68 1.38±0.96羧甲基纤维素钠滴眼液组 3.00±1.10① 2.06±1.18① 1.81±0.91 0.81±0.66②杞菊滴眼液低剂量组 2.94±1.24① 1.63±0.62① 1.44±0.63②④ 0.68±0.60②④杞菊滴眼液中剂量组 3.13±0.96① 1.87±0.72① 1.38±0.50②④ 0.43±0.51②④杞菊滴眼液高剂量组 3.06±0.93① 2.00±0.63① 1.25±0.44②③ 0.56±0.51②④

3 讨论

干眼症患者大多有肝肾阴虚的症状，治疗原则为“补肝明目”，因此设计使用杞菊滴眼液进行实验观察。杞菊滴眼液由4味中药组成，君药为枸杞子，主治肝肾阴虚、视力模糊或干涩眼痛，归肝、肾、肺经，可以滋肾、养肝、明目。臣药为野菊花，性微寒、味辛、苦，归肝、心经，清热解毒。佐药为黄精，性平、味甘，归脾、肺、肾经，滋阴润肺、补脾益气、滋肾填精，既能补中益气，又能养阴益精，与枸杞子、野菊花并用，阴阳互根，以滋阴补气。使药为薄荷脑，味辛性凉，具有疏风、清热、解毒等功效。

临床对干眼症诊断有多项测定指标，如schirmer试验、虎红染色、泪膜破裂时间、瞬目次数、角膜荧光素染色等方法。干眼症的主要临床症状为泪液分泌减少和角膜上皮损伤，对于实验性干眼症的研究，可选一个主要指标研究药物的有效性和比较不同药物作用的区别，本实验采用schirmer试验和角膜荧光素染色作为观察指标。

在对滴眼液药效的研究中，多先固定每日的用量和频次，检验不同浓度药物的效果，最终确定最佳的药物浓度。本次实验中药物的有效浓度已确定，主要观察不同频次对疗效的影响。

泪腺，主要由交感和副交感神经支配，是浆液性泪液的主要来源，抑制其作用可减少泪液分泌。Suwanapichon将肉毒毒素注射至大鼠泪腺，使泪液分泌减少〔3〕，大鼠全身注射东莨菪碱也可造成泪液减少〔4〕。兔的泪腺位于眶内，分为上泪腺和下泪腺，上泪腺位于眶内上眶壁内，起于鼻侧，止于上眶壁的中部，下泪腺位下眶壁内，起于鼻侧，止于颞侧。我们将阿托品注射至兔下泪腺的部位，其2分钟的schirmer平均值由8.61 mm下降为5.17 mm，前后差异有统计学意义（P＜0.05），说明该方法可达到抑制泪液分泌的目的。之后对实验家兔不断注射阿托品，使泪液分泌维持在低水平状态，治疗后第7天，杞菊滴眼液中、高剂量组Schirmer试验值均较溶剂对照组增加（P＜0.05），提示杞菊滴眼液对泪液分泌有促进作用。

大鼠泪腺分为眶内泪腺和眶外泪腺，眶内泪腺是哈德腺（Harderian gland），眶外泪腺是浆液腺，位于耳前皮下。将大鼠的眶外泪腺摘除，可造成泪液分泌减少，Fujihara 等〔2〕报道 schirmer试验下降 50%，我们的结果是下降60%～80%（另文发表）。泪液分泌减少，角膜可出现溃疡〔5〕，但角膜溃疡一般出现在干眼症的后期。我们在摘除大鼠泪腺后，使用苯扎溴铵溶液造成大鼠角膜损伤，模拟干眼症的上皮病变。由于泪腺摘除，使角膜上皮的修复延迟，有利于药物治疗作用的观察。我们的实验结果显示，杞菊滴眼液治疗14天和21天后，各剂量组大鼠角膜染色评分均低于溶剂对照组（P＜0.05），说明其对角膜上皮修复有促进作用，而角膜上皮修复是干眼症治疗的重要内容〔6〕，考虑其作用与药物中所含的丰富多糖、脂肪、蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等有关，它们对组织的修复是有益的。羧甲基纤维素钠滴眼液对治疗角膜上皮损伤也有效，可能由于它的粘稠性使眼表保留部分泪液，而泪液中含有表皮生长因子（EGF）等〔7〕，从而促使角膜上皮修复。

本实验的结果提示，杞菊滴眼液能增加泪液分泌和促进修复角膜损伤，有利于缓解干眼症的临床症状，有治疗干眼症的作用，且为中药制剂，患者可安全地使用。

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