人脂联素原核表达纯化及活性检测

王云龙，李永超，昌静峰，李玉林，王国强，邓黎黎，陈冬焕，董彩文，孙新城，刘旺根，梁晓艳

（1.河南工业大学，河南郑州 450001；2.郑州职业技术学院，河南郑州450121；3.河南省生物工程技术研究中心，河南郑州450001）

人脂联素原核表达纯化及活性检测

王云龙1，2，李永超1，昌静峰3，李玉林3，王国强3，邓黎黎3，陈冬焕3，董彩文3，孙新城3，刘旺根3，梁晓艳3

（1.河南工业大学，河南郑州 450001；2.郑州职业技术学院，河南郑州450121；3.河南省生物工程技术研究中心，河南郑州450001）

为了克隆人脂联素基因（ACRP30），获得有免疫活性的重组人脂联素，以人皮下脂肪组织为材料，提取总RNA，通过RT－PCR得到ACRP30基因。构建重组质粒pET－CKS－ACRP30，转化表达菌BL21（DE3），以IPTG诱导表达人脂联素重组蛋白，利用镍亲和层析纯化，Western blot鉴定其活性，双抗体夹心法检测其免疫活性。获得了人脂联素基因，表达纯化了人脂联素融合蛋白，融合蛋白分子质量约为50ku，表达量约占菌体总蛋白的30%，纯度达到90%，双抗体夹心法检测重组蛋白具有免疫活性。本研究成功表达了人脂联素重组蛋白且表达产物具有免疫活性，为人脂联素检测技术的建立奠定了基础。

人脂联素；原核表达；免疫活性

脂联素（adiponectin）是由脂肪细胞分泌的一种细胞因子，具有抗动脉粥样硬化、调节脂肪酸氧化和糖代谢、增加胰岛素敏感性、抑制肝糖产生、抑制反馈TNF－α的生成与释放，对损伤的肝细胞有重要的保护［1－3］。

脂联素是由244个氨基酸组成的胶原样蛋白，分子质量为30ku，故其基因又命名为ACRP30（adipocyte complement－related protein of 30ku）［4］。人脂联素基因位于染色体3q27，全长约17kb，由3个外显子和2个内含子组成［5］。研究发现肥胖者和Ⅱ型糖尿病患者血浆脂联素水平明显降低，说明脂联素与肥胖、胰岛素抵抗和Ⅱ型糖尿病有着密切联系，具有潜在的降糖、抗动脉粥样硬化以及抗炎效应［6］。

本研究以人脂肪组织为材料通过RT－PCR扩增出ACRP30全长片段，将ACRP30基因与表达载体pET－CKS连接，构建重组质粒 pET－CKS－ACRP30转化大肠埃希菌表达。载体pET－CKS含有His标签，为ACRP30重组蛋白的纯化提供了条件。对表达的重组蛋白免疫活性进行检测，为进一步开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

正常人脂肪组织来自河南省肿瘤医院非糖尿病人；克隆菌TOP10F′、表达载体pET－CKS及表达菌BL21（DE3）、组织总 RNA提取试剂盒、RT－PCR试剂盒、DNA回收试剂盒、Taq酶等由河南省生物工程技术研究中心提供；限制性内切酶、T4连接酶等为宝生物工程（大连）有限公司产品；脂联素标准品为惠安生物科技有限公司产品；人脂联素抗体、人脂联素酶标抗体为R＆D system公司产品。

PCR引物由上海博尚生物技术有限公司合成。上游引物：5′－CGGGATCC GCTAGC ATGCTGTTGCTGGGAGCTGTT－3′，下划线分别为BamHⅠ和NheⅠ酶切位点；下游引物：5′－CGGAATTC CTCGAG GTTGGTGTCATGGTAGAGAAGAA－3′，下划线分别为EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及RT－PCR 将人新鲜脂肪组织约200mg加入少量液氮充分碾磨均匀，提取总RNA，置－20℃保存［7］。取2μL总 RNA用 RTPCR试剂盒反转录、扩增，PCR循环参数为：94℃预变性5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，30个循环；72℃ 5min。15g/L 琼脂糖电泳，按照DNA回收试剂盒说明回收PCR产物。

1.2.2 pET－CKS－ACRP30表达载体构建及鉴定

用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ分别酶切PCR产物和质粒pET－CKS，并用DNA胶回收试剂盒分别回收ACRP30基因和线性化的载体片段。按载体与目的基因摩尔数1∶3～1∶8比例进行连接，T4连接酶连接16℃过夜。连接产物转化感受态TOP10F′，在LB平板（氨苄青霉素100mg/L、四环素5mg/L）上37℃过夜培养后，随机挑选3个菌落进行PCR鉴定。选择PCR阳性菌落，液体培养18 h，然后提取质粒，EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，鉴定正确的质粒寄送上海博尚生物技术有限公司测序。

1.2.3 人脂联素ACRP30在大肠埃希菌中的诱导表达 经测序正确的质粒转入表达菌BL21（DE3），挑取单菌落转接于3mL LB液体培养基（加有氨苄青霉素30mg/L，四环素5mg/L）中，37℃振荡培养过夜。分别取30μL菌液于4支3mL LB液体培养基中，1支为未诱导的空白对照，另3支诱导样品。37℃，200r/min摇床培养至OD600nm约为0.6～0.7时，加IPTG至终浓度为0.05mmol/L，其中1支37℃振荡培养5h，1支30℃振荡培养8h，1支25℃振荡培养12h。诱导结束后取出立即冰浴10min，5 000r/min离心10min收集菌体，超声波破菌后取上清和沉淀分别进行SDS－PAGE分析。

1.2.4 表达产物的 Western blot检测 诱导后的表达产物经100g/L SDS－PAGE电泳分离后，电转移至硝酸纤维薄膜（NC膜）上。50g/L脱脂奶粉封闭后，PBST洗膜5次，加1∶1 000稀释的人脂联素酶标抗体，室温振荡30min，NC膜用PBST洗5次后转移到10mL DAB溶液中，加入H2O2，室温避光轻摇3min显色。

1.2.5 表达产物的纯化 取阳性菌株37℃下进行大量培养，超声波破菌后离心收集包涵体，包涵体用TritonX－100洗1遍，用8mol/L尿素溶解。用镍亲和层析柱纯化，依次用含20、50、100 、200mmol/L咪唑的（8mol/L）尿素缓冲液洗脱，纯化后进行SDS－PAGE分析。用凝胶薄层扫描软件分析蛋白纯度。留取浓度较高的蛋白质溶液采用文献［8］的方法复性。

1.2.6 双抗体夹心法检测产物活性 依据产品说明书将脂联素抗体按1∶500稀释后包被到96孔酶标板上并封闭。将标准品（300ng/mL）、血清（分别稀释500、1 000、2 000倍）和纯化产物（重组人脂联素分别稀释5、10、20、40倍）50μL/孔分别加入1号～8号孔，空白孔加入100μL样品稀释液，再加入酶结合物50μL/孔；混匀，37℃反应1h。洗板后，加入显色剂A和显色剂B各50μL/孔，37℃反应20 min。加入终止液100μL/孔，酶标仪上用450nm和630nm双波长检测各孔的OD值（重复本试验2次，取检测的平均值）。

2 结果

2.1 RT－PCR结果

以人脂肪组织为材料提取RNA，通过RT－PCR获得了750bp的ACRp30基因片段（图1）。

图1 ACRP30片段PCR结果Fig.1 Identification ACRP30DNA of RT－PCR

2.2 菌落PCR鉴定结果

转化子pET－CKS－ACRP30采用菌落PCR初步鉴定，3个菌落均为阳性（图2）。

图2 重组质粒pET－CKS－ACRP30菌落PCR鉴定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pET－CKS－ACRP30

2.3 重组pET－CKS－ACRP30原核载体酶切鉴定结果

随机挑取菌落PCR为阳性的菌落摇菌，提取质粒后进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，可见750bp的ACRp30片段（图3）。

2.4 重组pET－CKS－ACRP30原核载体测序结果

将测序结果与GenBank收录的ACRP30进行比对，与GenBank上公布的序列（序列号NM－004797.2）同源性达到99%以上。

2.5 重组pET－CKS－ACRP30的表达及可溶性分析

分别取25℃（12h）、30℃（8h）、37℃（5h）诱导的菌体上清及沉淀进行SDS－PAGE电泳（图4），沉淀中较未诱导菌新增一条蛋白条带，其相对分子质量约50ku，与预期目的蛋白分子质量相符。但3个温度下，蛋白浓度无明显差异。考马斯亮蓝染色并经凝胶成像仪扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白量的30%。

图3 重组质粒pET－CKS－ACRP30酶切鉴定Fig.3 Identification of pET－CKS－ACRP30 by restriction enzyme digestion

图4 SDS－PAGE分析pET－CKS－ACRP30在不同条件下的表达Fig.4 Expression of pET－CKS－ACRP30under different conditions analyzed by SDS－PAGE

2.6 表达产物Western blot鉴定

利用人脂联素酶标抗体检测目的蛋白，证明所分离的蛋白是人脂联素的融合蛋白，且SDS－PAGE结果所示分子质量与预测大小相符，故得到的表达产物是目的蛋白（图5）。

2.7 目的蛋白纯化

pET－CKS多克隆位点上游有CKS－tag，下游有His－tag，30ku的ACRP30与两个标签融合表达构成的重组蛋白分子质量约50ku。包涵体经8 mol/L尿素溶解、镍离子亲合层析纯化，SDS－PAGE电泳（图6）证实纯化产物为单一蛋白，凝胶扫描显示纯度约为90%，且100mmol/L咪唑洗脱液中蛋白浓度最高。

图5 重组蛋白的免疫印迹分析Fig.5 Analysis of recombinant protein by Western blot

图6 SDS－PAGE分析表达产物纯化Fig.6 Purification of expressed products adiponectin analyzed by SDS－PAGE

2.8 免疫活性鉴定

双抗体夹心法检测试验（取3次检测结果平均值，表1）表明，虽然重组人脂联素比人血清中的脂联素活性低，但可以用作免疫原，用于人脂联素多抗和单克隆抗体制备。

表1 双抗体夹心ELISA检测重组人脂联素结果Table 1 The result of double antibody sandwich ELISA for recombinant human adiponectin

3 讨论

本研究从人脂肪细胞中提取RNA，经过RTPCR获得了人脂联素基因，与原核表达载体pETCKS进行重组，经测序后，与GenBank（登录号NM－004797.2）上公布的序列仅有1个核苷酸不同，引起此单核苷酸差异的原因可能如下：人与人之间的单核苷酸多态性；PCR过程中Taq酶的保真性不好，造成突变；在转化宿主菌后，培养过程中大肠埃希菌发生突变。但经DNA Ssist软件分析，表达的蛋白氨基酸序列完全相同。

目前人脂联素重组抗原、抗人脂联素单克隆抗体及多克隆抗体的制备报道很多［9］，但多数存在表达量低下，或生物活性受影响，或纯度不理想等问题。本研究使用pET－CKS表达载体采用T7启动子和蛋白质工程改造过CKS基因融合表达，选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性酶切位点，可将CKS融合标签去除。表达载体pET－CKS带有6个组氨酸的标签，可以用镍亲和柱收集，利于蛋白纯化与鉴定［10］。本研究获得的人脂联素虽然比标准品的活性稍低，但是能够满足脂联素检测试剂盒中所用标准品的要求。因此，本研究通过原核表达系统获得纯度较高且有免疫活性重组人脂联素蛋白，为制备人脂联素单克隆抗体和开发脂联素检测试剂盒奠定了基础。

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Prokaryotic Expression and Purification of Human Adiponectin and Its Immunological Activity Detection

WANG Yun－long1，2，LI Yong－chao1，CHANG Jing－feng3，LI Yu－lin3，WANG Guo－qiang3，DENG Li－li3，CHEN Dong－huan3，DONG Cai－wen3，SUN Xin－cheng3，LIU Wang－gen3，LIANG Xiao－yan3
（1.HenanUniversityofTechnology，Zhengzhou，Henan，450001；2.ZhengzhouTechnicalCollege，Zhengzhou，Henan，450121，China；3.HenanBiotechnologyResearchCenter，Zhengzhou，Henan，450001，China）

To clone the human adiponectin（ACRP30）cDNA and obtain the recombinant adiponectin with immunological activity，fresh human fat tissue was used for extracting total RNA and amplificating the adiponectin cDNA through RT－PCR.The recombinant plasmid pET－CKS－ACRP30was constructed and confirmed，and it was transduced into BL21（DE3）.Then the transformation was used for induced expression.The recombinant protein was identified by Western blotting and purified by Ni affinity chromatography.Finally，the sandwich ELISA method was developed for detecting the immunological activity of human adiponectin.Human adiponectin was expressed and purified，and the target protein is about 30%of the total bacterial protein，and the purity is around 90%.It is domenstrated that the aim protein has immunological activity with the sandwich ELISA.Adiponectin with immunological activity has been obtained from prokaryotic expression，which lays a foundation for establishing the detection method of human adiponectin.

human adiponectin；prokaryotic expression；immunological activity

Q789

A

1007－5038（2011）10－0036－04

2011－04－01

河南省科技创新团队和郑州市科技创新团队资助项目

王云龙（1962－），男，河南洛阳人，教授级高级工程师，主要从事生物工程技术研究。