泌乳期山羊腺垂体中ERα和ERβ的分布特点

吕颜枝，杨 爽，胡鹏翔，熊东升，耿阳雪，蒋振兴，赵慧英

（西北农林科技大学动物医学院 陕西杨陵712100）

泌乳期山羊腺垂体中ERα和ERβ的分布特点

吕颜枝，杨 爽，胡鹏翔，熊东升，耿阳雪，蒋振兴，赵慧英＊

（西北农林科技大学动物医学院 陕西杨陵712100）

为了获得ERα和ERβ在泌乳期参与腺垂体激素分泌的调节机理的形态学依据，试验采集泌乳初期、泌乳中期和泌乳后期山羊的腺垂体，用免疫组化SP法检测了ERα和ERβ在腺垂体的分布。结果表明，山羊腺垂体中ER两种亚型分布在腺垂体远侧部的嗜色细胞中；ERα阳性细胞数量随泌乳时间逐渐减少，泌乳初期和泌乳后期多呈胞质阳性，高峰期呈胞核阳性；ERβ的阳性细胞数量在泌乳初期和高峰期较多，泌乳后期较少，多为胞质阳性，高峰期伴有全细胞阳性，泌乳后期伴有个别核阳性。提示不同的泌乳时期ERα和ERβ分别分布在腺垂体远侧部中不同的嗜色细胞，泌乳前期和高峰期主要为PRL细胞，泌乳后乳期主要为嗜碱粒细胞，ERα和ERβ在泌乳各期腺垂体激素分泌中发挥不同的作用。

山羊腺垂体；泌乳期；雌激素受体；免疫组化

＊通讯作者

雌激素（estrogen）是一种作用广泛的类固醇激素［1］，主要由卵巢的卵泡上皮细胞和卵巢间质细胞分泌。卵巢雌激素的分泌受垂体促性腺激素的调节，同时雌激素也可以通过长反馈途径调节腺垂体激素的分泌。雌激素这些效应必须通过与其特异性的雌激素受体（estrogen receptor，ER）相结合后才能发挥，经典的ER主要由ERα和ERβ两种亚型组成［2］，分布于机体多种组织器官。在功能上ER介导的雌激素效应可能有所不同，但也可能协同发挥作用，ERα主要参与对生殖调控的作用，ERβ可能主要参与了对高级脑功能，如学习记忆、神经退行性疾病等的调节。有研究表明［3－6］，大鼠垂体组织中存在ER的表达；雌激素可诱发大鼠催乳素（prolactin，PRL）细胞内钙离子浓度迅速增加，导致PRL的释放，ER颉颃剂可以阻止这种作用；脑垂体内几乎所有的催乳素阳性细胞都不表达ERβ，而ERα对泌乳中枢的调节起着主要作用。目前，对于泌乳期山羊腺垂体中的ER的分布研究报道的很少，本试验应用免疫组化SP法对ERα和ERβ免疫反应产物在泌乳期山羊腺垂体细胞中的分布进行研究，为阐述山羊泌乳期的生理调节机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

自陕西杨陵区农户购买泌乳初期（当年2月份），泌乳中期（当年4月～5月份），泌乳后期（当年6月～7月份）的健康山羊各5只，共15只。抗兔链霉菌抗生物素－蛋白过氧化酶免疫组化超敏SP试剂盒、柠檬酸盐抗原修复液，为福州迈新生物技术公司产品；兔抗羊ERα和ERβ多克隆抗体及抗体稀释液为北京博奥森生物技术开发有限公司产品；德国Leica石蜡切片机，Motic数码显微镜。

1.2 方法

1.2.1 取材及材料处理 山羊放血处死后迅速取下羊头，先用37℃的生理盐水向两侧颈总动脉同时注入400mL～500mL冲干净血液，随后灌流4℃40g/L多聚甲醛固定液400mL～500mL，开颅取出垂体放入40g/L多聚甲醛固定液后固定24h。固定后的垂体用流水冲洗24h，再用梯度酒精脱水，二甲苯透明，之后浸蜡包埋，做石蜡连续切片（片厚6μm）。制作的石蜡切片贴于APES包被好的载玻片上，45℃ 烘箱烤片，共制备3套切片，分别用于ERα、ERβ免疫组织化学染色和阴性对照。

1.2.2 SP法染色 石蜡切片常规脱蜡水化后，用构椽酸盐缓冲液（pH6.0）对切片进行组织热抗原修复20min，冷却后进行免疫组织化学SP染色。免疫组织化学SP染色流程如下：①滴加过氧化物酶阻断液（试剂A）室，室温孵育10min；②滴加非免疫动物血清（试剂B），室温孵育10min～15min；③分别滴加兔抗羊（ERα、ERβ）多克隆抗体（稀释度为1∶200），4℃孵育过夜；④滴加生物素标记的二抗（试剂C），室温孵育10min～15min；⑤滴加链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液（试剂D），室温孵育10min～15min；以上每个步骤之间均用0.01mol/L的PBS缓冲液冲洗5min×3次，试验中的试剂A、B、C、D均来自SP试剂盒；然后用DAB呈色3min～5 min。阴性对照组用0.01mol/L的PBS代替一抗，其他步骤同上。最后经苏木素复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜观察、摄影。

2 结果

在整个泌乳时期的山羊腺垂体中均见到ERα、ERβ免疫反应阳性细胞，主要分布于远侧部的嗜色细胞，其数量和免疫阳性产物在细胞中的位置随着泌乳时期的不同而发生变化。ERα阳性细胞多分布于腺垂体远侧部血窦周围，着色细胞的数量随泌乳逐渐减少。泌乳初期多数分布于细胞质中（图1A），泌乳高峰期多分布于胞核，少量分布于胞质中（图1B）；乳期后期多分布于细胞质中，个别囊泡深着色（图1C）。

ERβ阳性细胞数量较多，在腺垂体的分布较集中，细胞个体相对于ERα阳性细胞大，泌乳初期免疫阳性产物多分布于胞质，也有个别全细胞着色（图2A）；泌乳高峰期全细胞着色增多（图2B）；泌乳后期阳性细胞数量明显减少，多数为胞质着色，伴有个别核着色（图2C）。

图1 泌乳各期腺垂体中ERα的分布（400×）Fig.1 The distribution of ERαin pituitary during different lactation periods（400×）

图2 图2泌乳各期腺垂体中ERβ的分布（400×）Fig.2 The distribution of ERβin pituitary during different lactation periods（400×）

3 讨论

泌乳启动和维持受PRL等激素的调节［8］。雌激素通过刺激垂体前叶合成与释放催乳素，促进乳腺的发育；大剂量的雌激素可竞争催乳素受体，从而抑制催乳素的促泌乳作用。在妊娠期，大量的雌、孕激素抑制了催乳素的促泌乳作用；分娩后，雌激素、孕激素水平迅速下降，解除了对催乳素的抑制作用，同时催乳素的分泌也大量增加，促进乳腺开始泌乳；随着规律性哺乳的建立，刺激垂体前叶分泌催乳素，从而维持泌乳。研究表明［9－11］在妊娠和泌乳期间腺垂体内的PRL细胞由于雌激素的刺激而发生增生和肥大，ER在分泌PRL和PRL细胞增生方面起重要作用，PRL细胞的大小和形态的变化与妊娠、泌乳等生殖周期密切相关。本试验发现，在ERα和ERβ在泌乳初期和高峰期内胞体较大，且ERβ在高峰期时数量增多，泌乳后期时胞体变小、数量急剧减少，提示泌乳前期和高峰期ERα和ERβ阳性细胞可能主要是PRL细胞，泌乳后期可能主要是嗜碱性细胞，两者共同参与了雌激素对泌乳期的生理调节，而泌乳高峰期是主要是ERβ起主要作用。但是确定ERα和ERβ具体定位于腺垂体中的何种激素分泌细胞，仍需做双标和其他细胞类型的鉴定研究。

张庆红等［12］对大鼠垂体中ER的分布研究中发现，ERα免疫反应物质位于细胞核内，ERβ免疫反应物质位于胞质和胞膜。本试验结果表明，泌乳过程中山羊腺垂体细胞中ERα和ERβ免疫反应阳性物质在细胞的定位不同，ERα多数位于胞质，少数存在于细胞核内，ERβ主要存在于胞质，个别全细胞着色，与上述的研究结果不完全一致，这提示不同的动物在不同的生理时期内ERα和ERβ在腺垂体中定位于不同的细胞中不同的位置，提示ER两种亚型在腺垂体中的分布的细胞类型不一样，在介导雌激素的作用可能有所侧重。

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Distribution of ERαand ERβin the Adenohypophysis of the Lactating Goats

L¨UYan－zhi，YANG Shuang，HU Peng－xiang，XIONG Dong－sheng，GENG Yang－xue，JIANG Zhen－xing，ZHAO Hui－ying

（CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA＆FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China）

In order to sthdy the distribution characteristics of ERαand ERβin the adenohypophysis of the lactating goats，the adenohypophysis of in early－lactation，peak lactation and later lactation goats were collected and made to slices to observe the localization of ERαand ERβpositive substance respectively by using immunohistochemical SP method.The results showed the ERαand ERβpositive cells mainly locate in eosinophils in the pars distalis of adenohypophysis.ERαpostive cells gradually decrease during lactation period，and mainly locate in cytoplasma in the early lactation and later lactation and in nucleus in peak lactation.The majority of ERβpositive cells scatter in the early lactation and the peak lactation，a few in the later lactation，and the positive products mainly distribute in cytoplasma.Whole－cell are colored in the peak lactation.The result indicated that ERαand ERβdistributed during different chromophil cells in the pars distalis of adenohypophysis In different lactation periods.ERαand ERβmay play a different role in the adenohypophysis hormone secretion during different lactation periods.

adenohypophysis；lactation；estrogen receptor；immunohistochemistry

S852.13

A

1007－5038（2011）10－0044－03

2011－04－29

西北农林科技大学国家级动物科学实验教学示范中心项目；抗病转基因牛新品种选育重大专项（2009ZX08007－008B）

吕颜枝（1984－），女，河北邯郸人，硕士研究生，主要从事神经免疫内分泌调控研究。