抗瘤中药调变结直肠癌细胞免疫抑制分子分泌的比较研究

李保红 崔澂 高峰 王润田 郑文广 张征峥

结直肠癌是目前世界上发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一。通过分泌转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、IL-4、IL-6、IL-10、PGE2 等免疫抑制分子抑制免疫功能从而逃避免疫监视，是结直肠癌发生发展的重要机制［1－3］。目前应用于结直肠癌的放、化疗药物多具有一定的不良反应，尤其是对免疫功能已显低下的患者，可致全身及肿瘤局部免疫功能进一步损伤。抗瘤中药制剂具有低毒、不对机体免疫系统造成损伤的特点，恰可弥补放、化疗在临床使用中的不足［4，5］。对其影响肿瘤免疫抑制分子分泌的研究，除本课题组外笔者尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株 小鼠结直肠癌细胞株Colon 26，为中国人民解放军白求恩军医学院训练部冻存。

1.2 主要试剂及仪器 RPMI-1640为GIBCO公司产品，每升完全培养液(Complete Medium，CM)中含小牛血清0.1 L、青霉素100000 U、链霉素100 mg;小牛血清由河北医科大学科技总公司提供，青霉素及链霉素为华北制药集团产品;MTT及DMSO 为美国 Sigma公司产品。TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-6、IL-10 酶联免疫检测试剂盒均为美国R＆D公司产品;PGE2检测试剂盒为上海阳光生物制品公司产品。Mk353型酶联免疫检测仪为芬兰ThermoLabsystems产品。

6种中药制剂:亚砷酸注射液为哈尔滨伊达药业有限公司产品，批号20040201，10 mg/10 ml，主要成分为三氧化二砷(As2O3)。盐酸川芎嗪(LHC)注射液为北京市永康药业有限公司产品，国药准字H 11020960，40 mg/2 ml。黄芪(AMB)注射液为成都地奥九泓制药厂产品，国药准字Z 51021776，20 g/10 ml。苦参素注射液为天津市生物化学制药厂产品，国药准字 H 12020506，0.2 g/2 ml，主要成分为氧化苦参碱(MOX)。猪苓多糖(PUPS)注射液为江苏正大天晴药业股份有限公司产品，ZZ-5458苏卫药准字(1999)第185701号，20 mg/2 ml。青蒿琥酯(ART)注射液为桂林南药股份有限公司产品，国药准字H 10930195，60 mg/瓶，以1 ml 5%NaHCO3溶解。所有中药制剂实验前均用CM稀释至所需浓度。

1.3 中药制剂作用浓度的确定 取对数生长期Colon 26细胞加入96孔板，再分别加入系列稀释的各种中药制剂;使肿瘤细胞终浓度为2×108/L，6种中药制剂的终浓度参见表1;设立无中药的单纯肿瘤细胞对照孔(Control);一式三复孔，混匀后置37℃ 5%CO2饱和湿度中培养48 h，MTT法检测A492值。选取对肿瘤细胞生长增殖无影响的中药制剂最高浓度作为实验用浓度。

表1 实验中6种抗瘤中药制剂的系列稀释浓度

1.4 中药制剂作用及作用后传代的Colon 26再培养上清的制备 取对数生长期Colon 26细胞，分别用含和不含确定浓度的不同中药制剂的CM悬至2×108/L，培养48 h后离心弃上清，收集的细胞洗涤后，以CM重悬至初始浓度(2×108/L)，培养48 h;离心收集的上清即分别为药物作用后的Colon 26第一次再培养上清(As-S1、LHC-S1、AMB-S1、MOX-S1、PUPS-S1、ARTS1)和未经药物作用同步培养的相应对照上清(Control-S1)。细胞再以CM重悬至初始浓度，再培养48 h;离心收集的上清即分别为药物作用后的Colon 26第2次再培养上清(As-S2、LHC-S2、AMB-S2、MOX-S2、PUPS-S2、ART-S2)和未经药物作用同步培养的相应对照上清(Control-S2)。细胞均用台盼蓝染色进行活细胞计数显示无差异。

1.5 Colon 26再培养上清中6种免疫抑制分子含量的检测TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-6、IL-10、PGE2 定量检测采用双抗体夹心ABC-ELISA法。严格按照试剂盒说明书操作，最后以酶联免疫检测仪测定A 492值;分别以系列稀释的相应标准品所检测的A 492值与标准品浓度对数值进行直线回归分析，根据直线回归方程得出各种待测上清中6种免疫抑制分子的含量。

1.6 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以表示，对所得结果进行方差分析齐性检验后，进行成组设计两样本均数比较的t或t’检验、单因素相关分析;采用F检验进行单因素方差分析(ANOVA)，q检验进一步对多个样本均数间进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验用中药制剂浓度的确定 与对照组比较，As2O3、LHC、AMB、MOX、PUPS和ART分别作用于终浓度为2×108/L的Colon 26细胞48 h后，MTT法检测A492值差异无统计学意义(均 P ＞ 0.05)的最高浓度分别为 0.5 mg/L、6 mg/L、250 g/L、0.3 g/L、125 mg/L、6.25 mg/L，即对 Colon 26 细胞无直接毒性作用的中药制剂最高浓度，确定为实验用浓度。分别经确定浓度的不同中药制剂作用48 h及作用后连续2次48 h再培养的Colon 26细胞，活细胞计数与对照组相比差异无统计学意义(P均＞0.05)。见表2。

表2 不同浓度的抗瘤中药制剂对Colon 26增殖的影响n=10，

表2 不同浓度的抗瘤中药制剂对Colon 26增殖的影响n=10，

注:与对照组 (1.084 ±0.111)比较，*P ＜0.05

中药制剂7个系列的稀释浓度1234567 As2O3(mg/L) 0.440 ±0.050* 0.518 ±0.068* 0.790 ±0.105* 0.840 ±0.068* 0.920 ±0.073*1.059 ±0.080 1.052 ±0.093 LHC(mg/L) 0.073 ±0.013* 0.675 ±0.060* 0.833 ±0.075* 0.919 ±0.083* 0.949 ±0.100* 1.063 ±0.092 1.055 ±0.105 AMB(g/L) 0.337 ±0.033* 0.793 ±0.129* 1.030 ±0.076 1.014 ±0.081 1.015 ±0.076 1.025 ±0.074 1.056 ±0.067 MOX(g/L) 0.078 ±0.009* 0.317 ±0.051* 0.521 ±0.061* 0.804 ±0.059* 0.895 ±0.068* 1.034 ±0.067 1.027 ±0.068 PUPS(mg/L) 0.765 ±0.066* 0.931 ±0.082* 0.952 ±0.097* 0.998 ±0.089* 1.017 ±0.094* 1.065 ±0.091 1.095 ±0.115 ART(mg/L) 0.218 ±0.040* 0.607 ±0.064* 0.890 ±0.099* 0.976 ±0.088* 1.031 ±0.098*1.060 ±0.094 1.084 ±0.108

2.2 中药制剂影响Colon 26免疫抑制分子分泌的比较分析6种中药制剂对 TGF-β1的影响有差别(F=425.699，P=0.000)，As2O3、MOX及ART作用后初始下调幅度差异无统计学意义(下调约25%，P均＞0.05)，LHC、AMB及PUPS作用后初始下调幅度有显著差异(分别下调约45%、50%和33%，均P=0.000);AMB的初始及持续下调幅度、维持时间均最显著，下调作用最强。对IL-6的影响差异有统计学意义(F=11.852，P=0.000)，AMB、MOX、PUPS 及 ART 作用后对 IL-6的分泌无影响或发挥上调作用;As2O3、LHC的下调幅度均约5%，但作用时相不同。对IL-10的影响差异有统计学意义(F=3.587，P=0.023)，除 PUPS 作用后可使 IL-10 上调约 2%外，其他5种中药制剂均可下调约5%左右;As2O3的初始及持续下调幅度、维持时间均最显著，下调作用最强。对PGE2的影响差异无统计学意义(F=2.587，P=0.063)，除 As2O3可延迟出现下调外，其他5种中药制剂均显示上调作用。对VEGF及IL-4的影响之间差异无统计学意义(分别为F=0.598，P=0.727;F=2.559，P=0.069)。见表3。

表3 中药制剂作用后Colon 26再培养上清中免疫抑制分子的含量变化n=3，pg/ml，

表3 中药制剂作用后Colon 26再培养上清中免疫抑制分子的含量变化n=3，pg/ml，

注:与 Control-S1 比较，*P ＜0.05;分别与 As-S1、LHC-S1、AMB-S1、MOX-S1、PUPS-S1、ART-S1 比较，#P ＜0.05;与 Control-S2 比较，△P ＜0.05

VEGF IL-4 IL-6 IL-10 PGE2 Control-S1 1295 ±30 29.18 ±1.90 27.70 ±0.70 26上清组别 TGF-β1.55 ±0.60 29.52 ±2.50 9.69 ±0.42 Control-S2 1266 ±20 29.30 ±1.80 27.65 ±1.70 26.63 ±1.00 29.63 ±1.90 9.71 ±0.44 As-S1 996 ±17* 28.25 ±0.14 27.01 ±0.13* 26.22 ±0.18 27.35 ±0.11* 26.33 ±0.25*As-S2 1026 ±19#△ 30.16 ±0.17 27.54 ±0.10# 25.56 ±0.09#△ 27.70 ±0.23△ 8.91 ±0.20#△LHC-S1 725 ±6* 28.56 ±2.11 28.12 ±0.22 25.24 ±0.78* 28.23 ±0.45* 27.04 ±0.66*LHC-S2 984 ±8#△ 29.23 ±0.86 27.47 ±0.56 26.58 ±0.34# 27.49 ±0.42#△ 25.78 ±0.25#△AMB-S1 640 ±5* 29.70 ±0.86 27.73 ±0.58 28.69 ±0.37* 27.99 ±0.61* 24.88 ±0.16*AMB-S2 561 ±5#△ 30.59 ±1.09 28.47 ±0.52 27.03 ±0.46# 29.68 ±0.30# 19.37 ±0.11#△MOX-S1 988 ±36* 29.31 ±2.04 28.54 ±0.52 26.38 ±0.59 28.21 ±0.64* 21.48 ±0.20*MOX-S2 627 ±6#△ 33.48 ±1.43#△ 29.46 ±0.63 26.49 ±0.37 28.13 ±0.51△ 12.19 ±0.18#△PUPS-S1 870 ±5* 28.09 ±1.27 27.90 ±0.14 26.81 ±0.66 30.04 ±0.45 28.06 ±0.32*PUPS-S2 949 ±8#△ 30.48 ±0.67#△ 29.98 ±0.34#△ 29.65 ±0.40#△ 31.85 ±0.88#△ 17.47 ±0.14#△ART-S1 988 ±7* 27.94 ±0.27 27.11 ±0.20 27.96 ±0.23 27.67 ±0.24* 30.72 ±0.74*ART-S2 668 ±6#△ 30.05 ±0.23 29.34 ±0.21#△ 28.79 ±0.19#△ 28.03 ±0.21△ 19.98 ±0.43#△

3 讨论

本研究发现，2×105/ml Colon 26分别经确定浓度的6种中药制剂作用48 h，及作用后彻底洗去中药制剂再行48 h传代培养，其活细胞计数与未经中药制剂作用同步对照培养的Colon 26差异无统计学意义(P＞0.05)。表明中药制剂作用后Colon 26细胞再培养上清中免疫抑制分子含量的变化，确系由中药制剂影响了Colon 26免疫抑制分子的分泌，而非改变肿瘤细胞的增殖存活状态所致。

本实验结果显示，Colon 26肿瘤细胞可分泌所测的6种免疫抑制分子，其中TGF-β1含量最高，可达(1295±30)pg/ml;6种中药制剂作用后，可分别调变免疫抑制分子分泌，并呈现差异性、多效性和重叠性。不同类别中药制剂影响分泌的种类、程度、出现及维持时间迥异，提示可能由于其有效成分及药理作用特点的差异，导致对结直肠癌细胞分泌免疫抑制分子的影响具各自不同的谱系特征;不同中药制剂对同一免疫抑制分子分泌的影响程度相同，可能是由于不同中药制剂的有效成分所发挥的效应相似所致。因此，下调肿瘤细胞免疫抑制分子的分泌，也应是中药制剂发挥抗瘤效应的机制之一。

目前已知的肿瘤免疫抑制分子中，TGF-β1的免疫抑制作用最强，受抑制的免疫细胞种类较广，且多种恶性肿瘤组织中TGF-β1蛋白及其mRNA表达异常增高，与肿瘤的分化、浸润、淋巴转移、TNM分级等有关，同时还与患者的短生存期及不良预后密切相关，直接影响临床抗瘤疗效［6－10］。本实验结果显示，在发生下调的免疫抑制分子中，以TGF-β1基础含量最高，降低幅度最大，下调幅度最高可达55.75%，且发挥下调效应的中药制剂种类最多，AMB、MOX、As2O3等对Colon 26肿瘤细胞分泌TGF-β1均具有强而持久的阻抑作用;而其他免疫抑制分子的基础含量偏低，降低幅度均较小，下调幅度最高仅7.35%，且针对其发挥下调效应的中药制剂种类多少不一。因此推测，TGF-β1是结直肠癌细胞分泌的优势免疫抑制分子，是各种中药制剂下调免疫抑制的重要靶分子;其它免疫抑制分子含量虽然也发生了变化，但可能并未发挥主导作用。

针对中医有关热毒内蕴、气滞血瘀、痰湿凝聚、正气虚弱的肿瘤病机，抗瘤中药制剂可分别通过以毒攻毒、清热解毒、活血化瘀、软坚散结、化痰祛湿、扶正祛邪等作用发挥效应。本文所选用的6种抗瘤中药制剂，As2O3属以毒攻毒类、MOX及ART属清热解毒类、LHC属活血化瘀类、PUPS属软坚散结及化痰祛湿类、AMB属扶正祛邪类。中医理论讲究辨证施治，即在全面分析病情及患者整体免疫状况的基础上，提倡多靶点联合用药、组合性个体化方案设计。本实验结果显示，AMB对结直肠癌细胞分泌TGF-β1的下调作用最强，As2O3对其他5种免疫抑制分子分泌的下调效应较显著;提示，临床可考虑联合使用扶正祛邪类(例如黄芪制剂)及以毒攻毒类(例如砷制剂)抗瘤药物组方，或许可较全面地调整患者不利于临床治疗的免疫抑制分子分泌状态。

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