细菌内毒素的生物危害性及其拮抗剂研究进展

王红芳 李菁 王明霞

革兰阴性细菌菌体自溶或被裂解时会释放细菌内毒素(LPS)，而且在革兰阴性细菌生长繁殖过程中，内毒素也会不断地从细菌外膜上脱落下来并释放到周围的介质中［1］。多种研究证实，LPS不仅是决定革兰阴性细菌感染的主要致病因素，还与人类其他许多疾病关系密切。目前，研究最为明确的LPS相关疾病是革兰阴性细菌所导致的脓毒症或感染性休克［1－3］。随着有创技术、免疫抑制剂、化疗尤其大量广谱抗生素的使用增多，脓毒症及感染性休克的发病率自20世纪50年代以来呈增多趋势，现代流行病学统计结果，全世界每1000例患者中就有3例发生脓毒症和感染性休克，同时这一数字还在以每年1.5% ～8%的速度上升。近年来，尽管抗感染治疗技术取得了长足的进步，但病死率仍高居不下，已成为临床医学界急需破解的难题。本文就细菌内毒素的危害性及其拮抗剂临床研究进展做一综述。

1 细菌内毒素的结构

细菌内毒素又为脂多糖(LPS)，与蛋白质及磷脂等一起构成革兰阴性菌的外膜，LPS的分子结构可以分为3个区域:O-特异性多糖链(也称为O-抗原)、核心多糖以及类脂A(Lipid A)［4］(图1)。其中，O-特异性多糖链突出于膜外 5 ～10 nm，在菌体表面呈游离状态，其基部与核心多糖相连。核心多糖由内核和外核构成，内核的内侧端以2-酮-3脱氧辛酸与类脂A相连。后者位于脂多糖的最内侧，并且嵌入细菌外膜双层磷脂分子的外叶。类脂A是LPS结构中最保守的成分，不存在种属特异性，是LPS的主要生物活性成分。每个细菌表面分布的LPS分子数量不定，约占细菌外膜结构的25%、外膜总表面积的75%。LPS单体的分子量多为5000～25000，由于LPS是由亲水性的多糖和亲脂性的类脂共同构成的一种两性大分子，此亲水基团和疏水基团在空间结构上位于分子的两端，因此，LPS在极性溶剂和非极性溶剂中均能形成多聚体，在电镜下呈清晰的微胶粒样。单体LPS首先与血浆中的脂多糖蛋白(LBP)结合形成复合物，然后再与CD14结合才能产生生物学效应，而多聚体的LPS不能与CD14结合发挥生物活性。

图1 细菌内毒素结构示意图

2 LPS的生物学危害

2.1 致热性 LPS进入机体后，刺激产生内生致热原细胞(主要是单核巨噬细胞等)使其释放内源性致热原［如白介素-1(IL-1)、白介素-2、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素及多种促炎性细胞因子］，这些内源性致热原作为基本信息分子以不同的途径将发热信号传入体温调节中枢［5］，使体温调定点上移，通过传出途径调节效应器对全身产热和散热做出反应，使产热大于散热，体温升高。LPS致发热高度在一定范围内与剂量呈正相关，并且有明显的潜伏期，人静脉注射2 ng/kg剂量时发热潜伏期可长达90 min。由于LPS对热具有稳定性，所以一般灭菌方法不能将LPS彻底破坏，不易清除。

2.2 凝血系统被激活 内毒素对凝血系统具有激活作用，与弥散性血管内凝血息息相关。普遍认为，内毒素引起血管内凝血，是由于诱导单核细胞和血管内皮细胞大量表达组织因子(TF)所致［6］。LPS首先与血浆中的LBP结合形成复合物，然后以复合物形式与单核/巨噬细胞以及血浆中的CD14结合，血浆中的这个大复合物再与血管内皮细胞结合，近来发现在单核/巨噬细胞和血管内皮细胞存在钟样受体(TLR)，为跨膜蛋白，其中的TLR 4主要识别并结合LPS-CD14复合物。LPS-CD14复合物与TLR 4结合以后，相继通过髓样细胞分化因子88至IL-1受体相关激酶等一系列效应启动TF基因转录、翻译以及蛋白修饰，最后TF蛋白以跨膜形式存在或以小囊泡形式释放。释放的TF与血浆中的FⅦ及FⅦa立即结合成FⅦ/TF和FⅦa/TF，后者激活后和FⅨ生成FⅦa/TF复合物，FⅩa和FⅨa又可反馈活化FⅦ/TF成为FⅦa/TF。FⅩa可以催化凝血酶原形成凝血酶，完成体内凝血过程的启动阶段。然后进入放大阶段:少量的凝血酶活化血小板，使氨基磷脂由细胞膜内侧转向外侧，构成凝血因子相互作用的催化表面。并且，少量的凝血酶还能活化FⅧ和FⅤ，FⅧa加速FⅨa对FⅩ的激活，FⅤa加速FⅩa对凝血酶原的激活。同时在活化的血小板表面，凝血酶激活FⅪ，于是FⅪa作为TF途径与“截短的”内源性途径的连接点，通过后者就可以快速地生成足量的凝血酶，从而促进纤维蛋白转化为纤维蛋白而凝血以及血栓的形成。

2.3 对细胞代谢的影响 严重创伤感染、脓毒血症可以导致机体出现包括体温升高、体重减轻和能量损耗的超代谢反应［7］。其主要的致病因素是由LPS激活体内多种髓系细胞如单核/巨噬细胞和非髓系细胞如内皮细胞、平滑肌细胞等，产生释放TNF、IL-1、白介素-6(IL-6)、NO及PGE2等多种细胞因子，参与机体急性期反应所致。例如:LPS刺激巨噬细胞可以引发一系列细胞因子、趋化因子的高水平释放，同时，巨噬细胞还通过高水平表达的黏附分子介导本身与其他细胞间的相互作用，启动炎性反应;LPS通过作用于炎性相关细胞导致多种炎性介质的释放，后者反过来作用于肝实质细胞而导致肝损伤［8，9］，而肝损伤是机体代谢障碍的本质;LPS还会导致肌细胞的过度降解等。最终导致机体出现对糖、蛋白质、脂肪的代谢异常，导致细胞能量的代谢障碍，最终导致细胞死亡。

2.4 与失控性炎症的关系 失控性炎症包括全身炎性反应综合征、代偿性抗炎反应综合征和混合性拮抗反应综合征等多个动态过程，临床上最为常见的病理现象，是创伤后并发症发生发展的重要机制。其中，参与炎性反应的重要物质是细胞因子，它既是免疫系统的信息传递介质，又是神经、内分泌系统及免疫系统间相互联系的重要纽带，这些细胞因子来源多样，功能多种，在体内构成纵横交错、纷繁复杂的细胞因子网络［10］。失控性炎症本质是由细胞因子链锁反应导致的一种介质病，而LPS是最常见的诱发失控性炎症的主要因素之一，被认为是这个链锁反应的“扳机”。LPS激活多种靶细胞如单核/巨噬细胞、粒细胞、内皮细胞、淋巴细胞等，释放多种细胞因子以及炎性介质，其中干扰素、TNF以及某些白介素等与脓毒血症的发病机制紧密关联;血栓素、血小板活化因子及补体系统的激活也与之相关;另外，还有诸如黏附分子、激肽及热休克蛋白、诱生型一氧化氮合酶等因子。此环节一经触发启动，就会遵循自身规律发展下去，细胞因子网络将作用于机体的多种组织、器官和系统，最重要的是免疫系统和血管内皮系统，它们的激活将导致炎症级联反应，形成“瀑布”式反应。

3 内毒素作用的拮抗剂

革兰阴性细菌在感染部位生长繁殖，释放的LPS进入血液可能会导致内毒素血症继而引发脓毒症，因此，在脓毒症的早期，合理使用抗菌药是必要的，但是细菌在被抗菌药杀灭的同时，由于外膜裂解会释放大量的LPS，而抗菌药没有对抗内毒素的作用。在中期和晚期，由于抗菌药的使用，大量细菌被杀灭，将加速内毒素的释放而加重病情，因此，在抗菌的同时，如何抑制细菌内毒素的释放或减缓内毒素对机体的损伤具有重要的临床实际意义。

3.1 多黏菌素B(polymyxin B) 多黏菌素是从多黏杆菌中分离的一类抗生素，用于临床的有多黏菌素B(PMB)和多黏菌素E(PME)，PMB通过其具有疏水性的阳离子结构与类脂A特异性结合，抑制LPS的生物活性。现今，对多黏菌素的研究热点之一在于将其作为LPS的吸附剂，Pusey CD 1991年在人工肾的基础上，用活性炭、PMB与树脂交联制成透析柱，对内毒素血症模型的大鼠进行血液透析，结果证明，被覆有PMB和活性炭的透析柱可明显降低模型大鼠中的LPS水平。李苑等［11］用固定有PMB短肽的聚苯乙烯微球对内毒素血症模型大鼠进行血液灌流实验，观察该吸附剂血液灌流清除血浆中内毒素的功效。实验结果表明，采用血液灌流吸附疗法成功地清除动物模型血液中的内毒素，而且，固定有多黏菌素B的特异吸附剂具有良好的血液相容性。目前，利用能与血液中LPS具有高亲和力物质所制备的各种透析装置在临床上已广泛应用。

3.2 糖皮质激素(glucocorticoid) 糖皮质激素应用于重度感染的治疗已久，目前，临床较常用的有氢化可的松、泼尼松、甲泼尼松以及地塞米松等。在脓毒症治疗中，糖皮质激素可以有效抑制LPS作用后多种细胞因子的产生，并直接稳定溶酶体膜以及抑制PLA2的活性，但也有报道证实对脓毒症及脓毒症休克患者使用大剂量糖皮质激素会产生明显的免疫抑制作用，且注入大量的糖皮质激素并不能提高脓毒症患者的生存率，还可能增加二次感染的几率而使病情恶化。由于在脓毒血症患者中肾上腺功能不足的发生率相当高，同时可能存在皮质醇耐受，甚至会出现糖皮质激素抵抗综合征，在给予低剂量糖皮质激素后，可能会收到较好效果。Tsao等［12］研究表明在使用小剂量地塞米松(0.1 mg/kg)能显著减弱由内毒素导致的循环衰竭和肾衰竭，降低病死率。Keh等［13］也报道小剂量糖皮质激素可纠正脓毒血症休克患者的血流动力学紊乱，以及免疫调节作用，其抗炎作用明显高于其对免疫功能的抑制作用，但对肾上腺功能良好的患者效果不明显。因此，临床上究竟采用多少剂量的糖皮质激素或使用多大剂量的促肾上腺皮质激素刺激肾上腺发挥功能来治疗脓毒症还需要进一步的研究。

3.3 阳离子抗微生物多肽(Cationic antimicrobial peptides)抗菌肽是由生物体产生的一类具有抗菌活性的多肽，它们在一级结构和长度上不尽相同，但分子表面均有亲水性区域和疏水性区域，分子量小，因富含精氨酸或赖氨酸，至少带有2个正电荷。等电点8.9～10.7，具有较强的阳离子特征。

研究表明，抗菌肽尤其是来自脊椎动物的抗菌肽，抗菌谱广，具有较强的直接杀灭有害微生物的作用［14］，同时还具有许多其他生物学功能。证据表明，许多抗菌肽并非直接杀灭细菌而是通过间接作用机制发挥抗感染作用［15］。抗菌肽的抗LPS作用机制复杂，它对于宿主具有平衡和调节炎症应答的作用，抑制LPS诱导的前炎性基因的表达，阻止某些细胞因子如TNF等的释放，同时产生和释放多种趋化因子来维持其他前炎性应答，更为重要的是抗菌肽并不单独作用于一个炎性调节子，而是作用于多种调节子，并有选择性的增强或抑制某一个或某些免疫应答，使它们成为很有力的抗LPS因子［16－18］。

3.4 杀菌性/通透性增加蛋白 (bactericidal/permeability increasing protein，BPI)BPI对革兰阴性杆菌具有杀菌和中和内毒素的作用，从而抑制内毒素刺激单核细胞产生细胞因子，但却具有强大的杀菌和中和内毒素的作用，故有“超级抗生素”之称。BPI是存在于人中性粒细胞嗜天青颗粒中的蛋白质，其在化学结构上与血浆中内毒素结合蛋白LBP具有同源性，在正常血液循环中BPI含量很低，大约是血浆中LBP的千分之一。天然BPI是由456个氨基酸残基构成的，相对分子量为55×103，等电点为pH值9.8，是一种能中和内毒素的内源性粒细胞蛋白质，与LPS的类脂A具有高度的亲和力，在较低浓度BPI就可以竞争性抑制LBP与LPS的结合，减少LPS-LBP复合物的形成及其向mCDl4等LPS受体的转运，从而拮抗LPS诱导的细胞激活反应［19］。因此，BPI常被认为是LBP的天然拮抗剂和LPS的抑制剂。无论是在动物实验，还是在临床革兰阴性细菌感染所致脓毒症治疗方面，BPI对革兰阴性菌具有强大的杀伤力，拮抗LPS的生物学效应，这与BPI对细菌外膜上的LPS有高强度的亲和力是密不可分的。

3.5 溶菌酶 (lysozyme) 人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻黏液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴组织中，1 ml眼泪中含 7 mg溶菌酶，1 ml乳汁中含 0.1 ～0.5 mg。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个 S-S键，分子量为14600，其活性部位在第78～115位的28个氨基酸残基序列，其中9个氨基酸残基具有杀菌活性。它是碱性蛋白，在体内接近中性的pH环境下带有大量正电荷，能与带有负电荷的病毒蛋白结合，也可与LPS结合，具有抗病毒、抗细菌内毒素的作用。人溶菌酶的活性约为蛋清溶菌酶活性的3倍。溶菌酶虽在人体内分布广泛但提取困难。目前已有人将其基因克隆到原核和真核生物中进行表达，利用DNA重组技术获取人溶菌酶。

溶菌酶广泛存在于动植物体内，不同来源的溶菌酶的结构和生物活性各不相同，动物溶酶菌的溶菌活性远远低于人溶菌酶，而植物来源的溶菌酶活性更低。目前国内主要从蛋清和蛋壳中提取制备蛋清溶菌酶，已形成规模化，并且，由蛋清溶菌酶制成的口含片和肠溶片已进入临床应用阶段。因此，蛋清溶菌酶是近年来研究的热点。研究表明，蛋清溶菌酶没有明显地直接杀灭革兰氏阴性菌的作用，但在与抗生素联用后，能明显抑制LPS的释放，进而多种细胞因子的产生释放减少，从而缓解LPS 所致的炎性反应［20］。

3.6 中药及中药提取成分(Extracts of traditional chinese medicine and chinese medicine) 随着中医中药的现代化发展，以及中西医理论的结合，近五十年来，许多中药、中药提取的单体及复方均被证实有对抗LPS的作用，与抗菌药等联用在攻克重度细菌感染、脓毒症及感染性休克等疾病的实验研究和临床治疗方面取得了一定的成效。许峰等［21］证实丹参素等在体内体外均能抑制LPS刺激的白细胞分泌TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子，提高内毒素攻击小鼠的生存率。近年来，吕根法等［22］利用生物传感技术，以类脂A为靶点，测定中草药和Lipid A的结合能力，进而考察中草药成分中和细菌内毒素的效果，为筛选对抗LPS的中草药提供了一条快捷途径，具有准确、快速、高效、直观等特点。常明向等［23］研制的含大黄、茵陈、栀子等的复方制剂利胆排毒口服液对内毒素有直接破坏作用，能显著降低感染性休克小鼠的病死率。

另外，还有其他如重组人生长激素、CMP-KDO合成酶抑制剂、人乳铁传递蛋白、以及细胞因子拮抗剂等多种对抗LPS的物质，它们在减少细菌和内毒素易位，从而有效防止感染扩散、抑制LPS合成、阻断LPS与其相应受体的结合，以及通过抑制细胞因子的释放或抑制其生物活性等，可避免或减轻LPS介导的炎性反应对机体造成的损伤。

1 Sands KE，Bates DW，Lanken PN，et al.Epidemiology of sepsis syndrome in 8 academic medical centers.JAMA，1997，278:234.

2 Angus DC，Linde-Zwirble WT，Lidicker J，et al.Epidemiology of severe sepsis in the United States:analysis of incidence，outcome，and associated costs of care.Crit Care Med，2001，29:1303.

3 Richard P，Darveau U.Lipid A diversity and the innate host response to bacterial infection.Curr Opinion Microb，1998，1:36.

4 徐建国主编.分子医学细菌学.第1版.北京:中国科学出版社，2000.116-130.

5 Roth J，Souza GEP.Fever induction pathways:evidence from responses to systemic or local cytokine formation.Braz J Med Biol Res，2001，34:301.

6 王鸿利.炎症-凝血网络与血栓形成的关系.外科理论与实践，2006，11:61-63.

7 汪仕良，尤忠义，余斌，等.烧伤后肠源性高代谢研究——高代谢及内毒素.肠外与肠内营养，2005，12:24-28.

8 鲍启德，杨兰兰，崔东来.Toll样受体4与肝损伤.国外医学消化系疾病分册，2005，25:381-383

9 陈腾祥.内毒素休克小鼠肝脏核蛋白质组学研究.博士论文.第一军医大学.2007.

10 Calvano SE，Xiao W，Richards DR，et al.A network-based analysis of systemic inflammation in humans.Nature，2005，437:1032-1037.

11 李苑，王翔，熊兴梁，等.固定多粘菌素B的新型吸附剂对血液中细菌内毒素吸附性能的实验研究.生物医学工程杂志，2006，23:832-835.

12 Tsao CM，Ho ST，Chen A，et al.Low-dose dexamethasone ameliorates circulatory failure and renal dysfunction in conscious rats with endotoxemia.Shock，2004，21:484-491.

13 Keh D，Boehnke T，Weher-Cartens S，et al.Immunologic and hemodynamic effects of“Low-dose”hydrocortisone in septic shock:a doubleblind，randomized，placebo-controlled，crossover study.Am J Respir Crit Care Med，2003，167:512-520.

14 刘倚帆，徐良，朱海燕，等.抗菌肽与抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的体外协同抗菌效果研究.动物营养学报，2010，22:1457-1463.

15 Nijnik A，Hancock REW.Host defence peptides antimicrobial and immunomodulatory activity and potential applications for tackling antibiotic-resistant infections.Emerging Health Threats Journal，2009，2:1-7.

16 Mookherjee N，Brown KL，Bowdish DM，et al.Modulation of the TLR-mediated inflammatory response by the endogenous human host defense peptide LL-37.J Immunol，2006，176:2455-2464.

17 Holzl MA，Hofer J，Steinberger P，et al.Host antimicrobial proteins as endogenous immunomodulators.Immunol Lett，2008，119:4-11.

18 Lai Y，Gallorl.AMPed up immunity:how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.Trends Immunl，2009，30:131-141.

19 Canny G，Cario E，Lennartsson A，et al.Functionai and biochemical characterization of epithelial bactericidal/permeability-increasing protein.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290:557-567.

20 梁爱华，薛宝云，梁日欣，等.鸡蛋清溶菌酶对头孢他啶诱导铜绿假单孢菌内毒素释放的抑制作用.药学学报，2003，38:801-804.

21 许峰，陆伯刚，姚智，等.丹参及丹参素对内毒素刺激下肝巨噬细胞分泌细胞因子影响的动态观察.中国危重病急救医学，1996，8:262.

22 吕根法，五天顺，郑宏治，等.以类脂A为靶点应用生物传感器技术筛选抗内毒素中草药.河南科技大学学报(医学版)，2010，28:1-4.

23 常明向，章晶，陈科力.利胆排毒口服液抗内毒素作用实验研究.中成药，2007，29:1506-1508.