内切酶与端肽酶水解牛乳酪蛋白的研究

丁 勇，孔 芳，衣杰荣，包建强

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

牛乳中含有大量的蛋白质，其含量约为牛乳的3.3～3.5%，主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋白和一些具有重要生理功能的酶类。酪蛋白在牛乳中占蛋白质总量的80%～82%，并且酪蛋白中含有人体必需的8种氨基酸，是一种全价蛋白质（PER值为2.5），能够为生物体生长发育提供必需的氨基酸。酪蛋白水解后，可离出多种活性物质，按其功能分为：降血压肽、抗血栓肽、免疫活性肽、促进矿物离子吸收肽、抗菌肽等[1-2]。用酶法水解酪蛋白具有条件缓和、环境适宜和不破坏营养等好处，是蛋白质水解技术开发研究的方向。但在水解后，蛋白质经酶水解得到的多肽往往带有较明显的苦味，限制了其在食品中的应用。应用游离的疏水性氨基酸无明显的苦味的特性，用外切酶将位于端基的疏水性氨基酸残基切下，可有效的减少水解液中的苦味。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛乳酪蛋白（上海贝基生物科技有限公司，蛋白质含量实测值为 81.2%）；Alcalase 2.4 L和Flavourzyme（丹麦诺维信公司）；1 mol/L的氢氧化钠标准溶液（自配）；中性甲醛溶液（自配）。AL204电子天平（上海梅特勒-托利多公司）；HWS12型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；FE20精密pH计（上海梅特勒-托利多公司）；磁力搅拌器；离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白水解度的测定 水解度的测定采用pH-stat滴定法[3-4]。

1.2.2 Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白优化设计影响酪蛋白水解度的因素主要有：A底物浓度，B水解介质的pH值，C温度和D加酶量。笔者用磷酸盐缓冲液作为溶媒，考察底物浓度、pH值、温度及加酶量对枯草杆菌碱性蛋白酶水解牛乳酪蛋白的影响，以水解度作为评价指标。该试验采用正交表L9（34）安排试验，试验因素和水平的选择如表1所示。

表1 Alcalase水解牛乳酪蛋白正交试验因素水平表

1.2.3 Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白Alcalase 2.4 L水解液的优化设计 本研究选A：pH值，B：酶量（μL），C 温度（℃），D 时间（h），用中性甲醛滴定法[3]以滴定中消耗碱的量作为评价Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的程度，选用L16（44）正交表安排试验，试验设计如表2。

表2 Flavourzyme酶解正交试验因素水平表

1.2.4 苦味评分标准[5-6]称取奎啉0.1 g溶于50 mL 5%乙醇溶液中，从中取5 mL溶液用蒸馏水稀释到100 mL，得到1.0×10-4g/mL等浓度的奎啉溶液，再进一步稀释成 5.0×10-5、2.5×10-5、1.0×10-5、5.0×10-6g/mL等浓度的奎啉溶液，其苦味值分别定为 10.0、5.0、2.5、1.0、0.5，将制得的多肽溶液与不同浓度奎啉溶液比较，从而确定多肽的苦味值。

2 结果与分析

2.1 Alcalase 2.4 L酶解牛乳酪蛋白

研究按照Alcalase 2.4 L水解牛乳酪蛋白优化设计的方案，选用L9（34）正交表进行试验，结果见表3。

表3 Alcalase酶解牛乳酪蛋白正交试验结果

如表3所示，通过直观分析法对试验结果作了分析。经过对极差分析和比较（B>A>C>D）可以看出：各因素对Alcalase酶水解酪蛋白水解度的影响主次顺序依次为B、A、C、D，表明溶媒的pH值对酪蛋白的水解度影响最大，其次依次是底物浓度、温度、加酶量。根据表3中K1、K2、K3值的大小确定各因素的最优水平组合为A1B3C3D2，即试验的最佳水解条件为：底物浓度2%、pH值8.5、温度为55℃、加酶量为 20 μL。

2.2 Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白Alcalase 2.4 L水解液

本研究选 A：pH 值，B：酶量（mL），C温度（℃），D时间（h），用中性甲醛滴定法以滴定中消耗碱的量作为评价Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的程度，选用L16（44）正交表安排试验，试验结果见表4。

如表4所示，通过直观分析法对试验结果作了分析。经过对极差分析和比较（B＞D＞C＞A）可以看出：各因素对Flavourzyme酶解牛乳酪蛋白的影响主 次 顺 序 依 次 为 B、D、C、A， 即 加 酶 量 对Flavourzyme酶解影响最大，其次依次是时间、温度、pH 值。根据表4 中 K1、K2、K3、K4值的大小确定各因素的最优水平组合为A3B3C1D3，即试验的最佳酶解条件为：pH值6.5、加酶量为120 μL、温度为55℃、时间 3 h。

表4 Flavourzyme酶解正交试验结果

2.3 苦味值评价结果

首先评价单一使用Alcalase 2.4 L的苦味值，苦味值较明显，根据评定，苦味值为5。随后随着风味蛋白酶的加入水解完成后水解液的苦味有了大幅度的降低，根据评定水解液的苦味值降至2.5。风味蛋白酶是一种内切酶和外切酶的混合酶，能够有效地将疏水性氨基酸从多肽端切除，降低多肽的苦味。

3 结 论

在酪蛋白水解过程中，pH值可能影响中间络合物的解离状态，不利于催化生成产物。由于Alcalase 2.4 L酶水解酪蛋白过程中溶液是由碱性至酸性变化的，所以保持pH值恒定对于酶水解反应至关重要。

加入风味蛋白酶后水解液的pH值无明显变化，用pH-stat法计算得到水解液的水解度几乎不变。后来改用测定氨基氮含量的方法反映水解度的变化，结果表明了随着水解时间的延长，水解液中氨基氮含量明显呈上升趋势。同时，蛋白质水解液的苦味值得到大幅度降低。离心后得到的蛋白质水解液具有水解度高，透明澄清，低苦味的特点。为下一步功能肽的分离制备奠定了基础。

[1] 李小晖.牛乳中酪蛋白的结构特性及其应用[J].食品工业，2002，（1）：29-31.

[2] 孔 芳，衣杰荣，丁 勇.枯草杆菌蛋白酶水解牛乳酪蛋白的条件研究[J].湖南农业科学，2009，（6）：9-11.

[3] Adler Nissen.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins[M].London:Elsevier Applied Science Publishers,1986.116-124.

[4] 袁 斌，吕桂善，刘小玲.蛋白质水解度的简易测定方法[J].广西农业生物科学，2002，（2）：113-115.

[5] 赵新淮.大豆水解物水解度测定的研究[J].东北农业大学学报，1995，26（2）：178-181.

[6] 吴建中，赵谋明，宁正祥，等.双酶法生产低苦味大豆多肽研究[J].食品工业科技，2003，（4）：24-26.