HPLC法测定2-甲氧基雌二醇原料药中主药和有关物质的含量

李杨，施秀芳，王丹丹，张超峰，杜斌#（1.河南省食品药品检验所，郑州市450003；.郑州大学药学院，郑州市 450001）

2-甲氧基雌二醇（2-Methoxyestradiol，2-ME）为雌二醇的生理代谢产物，研究[1]发现其具有抗多种肿瘤的活性，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌及造血系统肿瘤白血病及骨髓瘤等。国外关于该药的研究已经进入Ⅱ期临床阶段，国内关于2-ME的报道多集中于合成、药理、药动学及制剂方面的研究[2]，尚未见其质量标准方面的报道。为此，笔者在本文中建立了测定2-ME原料药中主药和有关物质含量的高效液相色谱（HPLC）方法，结果表明，该方法准确、快速、分离度好、灵敏度高，可用于其质量控制。

1 仪器与试药

1200型液相色谱分析仪、紫外-可见检测器及其分析软件（美国Agilent公司）。

2-ME 原料药（批号：090610、090611、090612，纯度：＞98.5%）、2-ME对照品（批号：20090722，纯度：＞99.5%）均由郑州大学药学院提供；甲醇为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水＝65∶35，流速：1.0m L·m in－1；柱温：30℃；检测波长：285 nm[3]；进样量：20μL。理论板数按2-ME峰计算，不得低于3 000。

2.2 线性关系考察

对照品贮备液的制备：精密称取2-ME对照品约10mg，置于50m L容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

精密量取对照品贮备液2.0、3.0、5.0、7.5、10m L，置于10 m L容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱，以浓度（c）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A＝12.6c－11.8（r＝0.999 8）。结果表明，2-ME检测浓度线性范围为45.96～229.8 μg·m L－1。

2.3 重复性与中间精密度试验

精密量取“2.2”项下对照品贮备液5.0m L置于10m L容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。照“2.1”项下色谱条件重复进样5次，测定峰面积，计算其RSD＝0.1%（n＝5）。更换仪器，由不同人员操作，在不同时间测定同一批样品（批号：090610），含量结果分别为100.4%、99.8%、100.2%，RSD＝0.3%，可见该方法重复性和中间精密度良好。

2.4 稳定性试验

取“2.8.2”项下的供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件分别在0、1、2、4、5、8、10 h进样，测得峰面积，计算其RSD＝0.4%。结果表明，溶液在10 h内稳定性好。

2.5 破坏性试验[4]

取2-ME原料药5份，分别进行酸破坏（以1mol·L－1盐酸的甲醇溶液制备2-ME溶液，破坏48 h后，用氢氧化钠甲醇溶液中和）、碱破坏（以0.1mol·L－1氢氧化钠的甲醇溶液制备2-ME溶液，破坏48 h后，用盐酸甲醇溶液中和）、氧化破坏（以3%过氧化氢的甲醇溶液制备2-ME溶液，破坏48 h）（前3种溶液终浓度均为“2.8.1”项下供试品溶液浓度）、高温破坏（将样品置于80℃的烘箱中48 h，然后取出，按照“2.8.1”项下的方法制备供试品溶液）、光照破坏（将一定量的样品置于8 000 lx强光下照射5 d，然后取出，按照“2.8.1”项下的方法制备供试品溶液），进样分析，记录色谱至主成分保留时间的2.5倍。结果表明，在选定的色谱条件下，2-ME的理论板数大于3 000，各杂质峰与主峰的分离度都大于1.5，供试品在强酸中有所降解，在原有杂质与主峰之间又产生2个新杂质；在强碱中也有所降解，在产生新杂质的同时，原有杂质消失；在氧化破坏中，原有杂质明显减少，并在主峰后产生1个新杂质峰；光照和高温下供试品相对稳定；且各破坏条件下的降解物均与主峰分离良好，结果详见图1。

图1 破坏性试验高效液相色谱图A.未破坏样品；B.酸破坏后样品；C.碱破坏后样品；D.氧化破坏后样品；E.高温破坏后样品；F.光照破坏后样品；1.2-ME；2.过氧化氢Fig 1 HPLC chromatogramsof destructive testsA.undestroyed sample；B.sample destroyed by acid；C.sample destroyed by alkali；D.sample destroyed by oxidation；E.sample destroyed by high temperature；F.sample destroyed by light；1.2-methoxyestradiol；2.hydrogen peroxide

2.6 回收率试验[5]

取批号为090610的原料药适量，精密称定，置于100m L容量瓶中，以甲醇为溶剂，分别制备低、中、高3个浓度（约80、100、120 μg·m L－1）的溶液各3份，作为回收率测定溶液，精密量取20μL，进样分析，记录色谱；另取对照品适量，精密称定，用甲醇制成100μg·m L－1的溶液，作为对照品溶液，同法测定。采用外标法计算，结果，平均回收率为98.9%（RSD＝0.7%），详见表1。

表1 回收率测定结果（n＝9）Tab 1 Resultof recovery test（n＝9）

2.7 检测限和定量限

按照信噪比为3∶1时作为检测限，结果为2 ng；按照信噪比为10∶1时作为定量限，结果为10 ng。

2.8 样品测定

2.8.1 有关物质[6]。取本品，加甲醇溶解并稀释制成每1m L中含3mg的溶液作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇制成每1m L中含60μg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的20%～25%。再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的主峰面积（2.0%）。通过自身对照法计算结果显示，3批样品中杂质的峰面积之和均小于对照溶液主峰面积（2.0%），含量分别为1.1%、1.4%、1.5%，均低于2.0%。

2.8.2 主药含量测定。取2-ME原料药约10mg，精密称定，置于100m L容量瓶中，用甲醇适量使之溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱。另取对照品适量，精密称定，用甲醇制成100μg·m L－1的溶液，作为对照品溶液，同法测定。采用外标法计算，结果3批样品中主药的含量均在98%以上，详见表2。

表2 样品中主药含量测定结果（n＝3）Tab 2 Resultsof content determ ination of sam ples（n＝3）

3 讨论

3.1 分析方法的选择

由于2-ME有紫外吸收[3]，因此在含量测定时，选择分离能力强的HPLC法，可同时进行有关物质检查。根据相关指导原则建议，色谱柱首选C18，流动相首选甲醇-水系统。2-ME的紫外光谱（甲醇为溶剂）显示，其在205、285 nm波长处有最大吸收[7]；由于甲醇的末端吸收也在205 nm波长附近，因此甲醇-水系统不能用205 nm波长进行检测，故选择285 nm波长进行检测，结果满足分析要求。

3.2 有关物质检查

首先考虑薄层色谱法，根据合成工艺[8]，以二氯甲烷和丙酮为展开剂，采用硅胶G板，点样，但未显现杂质斑点。此后更换多种展开剂后，效果均不理想，最好的结果是采用氯仿-环己烷-二氧六环-三乙胺（4.5∶4.1∶0.6∶0.8）为展开剂，以二氧六环-水（9∶1）为溶剂后，在主斑点下方显示1个杂质斑点，杂质个数少于液相色谱检出的杂质个数（3个），故最终还是采用液相色谱方法。为了能够充分显示杂质峰，经过多次试验，在保证不过载的前提下，将供试品溶液的浓度设在3mg·m L－1。根据《美国药典》[9]关于雌激素类的标准控制及多次试验结果表明，杂质的总含量均不大于1.5%。由于2-ME易溶于有机溶剂[10]，难溶于水，因此在破坏性试验中，酸、碱溶液采用的是甲醇作溶剂。

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[2]李栋梁，潘 峻.2-甲氧基雌二醇的抗肿瘤作用研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2008，15（20）：1 595.

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[4]李晚生.高效液相色谱法测定巴柳氮片中的含量及检查有关物质[J].中国药房，2005，16（23）：1 826.

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[6]李金林，周小娟，安利霞，等.HPLC法测定吡诺克辛钠滴眼液中主药及有关物质的含量[J].中国药房，2008，19（34）：2 696.

[7]Du B，LiY，Li X，et al.LC w ith fluorescence detection for the tissue pharmacokinetics of 2-methoxyestradiol solution and liposome after intravenous administrations to rats[J].Chromatographia，2009，70（4）：1 287.

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